【求助】我的表达问题（路过的请进）

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标题:【求助】我的表达问题（路过的请进）

PCR[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我是用载体pHIL-S1在毕赤酵母GS115中进行表达的。在invitrogen的protocol上没有提到用G418来筛选，而只说了用AOX1引物做PCR和用MM/MD来筛选出Muts和Mut+。我也是按照上面做的，并且PCR也得到了2.2KB和我要的目的带，用MM/MD也筛选也出现了明显的差别（即：在MM/MD上长的不一样）。忘记说了，这个载体是分泌型的。
但是问题就出现在表达环节上。按照protocol上面的步骤，我分别在诱导6、12、24、30小时取样，并取上清做SDS-PAGE分析。按照道理说，应该只有一条带出现，但是却出现了两条带。其中的一条和目的带大小差不多，而另一条则要大很多。请高人为我解释一下吧。
谢谢了。

jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

回复 #1 PCR 的帖子

可能目标蛋白在表达过程中发生了转录后修饰，增加了糖基化，分子量偏大是正常的。至于有两条带，可以做一个阴性和阳性的对照，确认一下是不是表达所产生的。至于那个带是你要的目标蛋白，有必要的话，要用western或纯化后分离鉴定。

lixi559[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

另一条大很多的可能是蛋白的二聚体或者多聚体吧

greenbee[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

western吧，是否为目的蛋白就清楚了。再考虑翻译后修饰的问题。

PCR[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢各位了
我也想过用western日，但是，由于我表达的这个基因目前没有人做过，也就找不到合适的抗体来进行western。同时，这个载体没有his等之类的标签。
“另一条大很多的可能是蛋白的二聚体或者多聚体吧 ”我觉得不是很有可能，用SDS-PAGE进行电泳的话，不是能把蛋白的亚基能分开的吗？怎么能是二聚体或者多聚体呢？
我目前也只是通过其大小来判断。还有其他的什么方法吗？

PCR[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

假如说是翻译后修饰的问题，我应该怎么办呢

one[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

做对照吧，多设几个对照，设一个未诱导的，设一个宿主诱导的，再设一个含载体的诱导的。看看那条大带是由谁引起的。

PCR[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢！
最近有个怪问题，以前表达的很好，现在却感觉表达量很小，有时候用上清几乎就看不见。有什么办法解决吗？
另外，SDS-PAGE的胶最近老是很难凝，这究竟是怎么回事啊？能否给予我帮助。谢谢！

DDD[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 PCR 于 2014-7-5 17:23 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢！
最近有个怪问题，以前表达的很好，现在却感觉表达量很小，有时候用上清几乎就看不见。有什么办法解决吗？
另外，SDS-PAGE的胶最近老是很难凝，这究竟是怎么回事啊？能否给予我帮助。谢谢！ ...

表达量降低可能的原因是菌种退化，以前表达量高的时候按时保存菌种，并定期转接，有必要的话重新转化。
PAGE胶难以凝结，问题一般处在过硫酸铵和TMED上面，这两种试剂作为催化剂未丙稀酰胺聚合提供自由基，用量不足或放置过久引起的变质都会减弱聚合反应，试试重新配制过硫酸铵。

bongte[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我说一句挺弱的话：
两条带，有一条是不是菌体本身的啊！
一般阴性对照我设两个：空载体加IPTG同等条件诱导
质粒（含有目的片断）转菌后不加IPTG诱导
有些细菌它本身就有蛋白表达！

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