【求助】确定磷酸化位点

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标题:【求助】确定磷酸化位点

kulee[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

手头有一个蛋白质(约160kDa),已证明可分别被几种激酶磷酸化,且磷酸化位点初步限定在几个范围(约100个aa)之内,现在要确定具体的磷酸化位点,请教大家应该采取什么技术路线?
有能避免使用同位素的方法吗?
确定一个激酶对该蛋白的磷酸化位点(不止一个位点),如果用MS,大约需要多少钱?
北京地区做MS做得比较好的单位有哪些或者是哪位老师?

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最简单的方法，查有没有这样的特异性磷酸化位点的单抗卖？

kulee[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

可是要确定具体在哪个位点上磷酸化啊

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

有磷酸化特异性的抗体，针对某个特定表位的，呵呵，就看你运气好不好了，能不能找到这样的抗体，要是能免疫反映，那就可以确认是这个抗体所针对的表位上的位置磷酸化
我想这是最简单的方法吧
呵呵Smile

loli[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.如果是 Tyr磷酸化，且这100个aa内含的Tyr比较少的话，
可以考虑做点突变后做in vitro kinase assay，然后用抗Tyr磷酸化的抗体检测看哪些点突变后不发生磷酸化。（没有抗ser/thr磷酸化的抗体，所以该方法不适用于ser/thr磷酸化的情况)
2. MS是比较好的方法，不过如果两个位点隔得比较近的话也不太好确定。

kulee[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

被loli言中,这个蛋白是ser/thr磷酸化的情况 Evil
能把MS讲得具体点吗?对样品是什么要求?

loli[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我们实验室只做过Tyr磷酸化的：
首先原核表达纯化该蛋白（不一定要全长，包含有磷酸化位点的片断即可），然后加入过表达特定激酶的细胞裂解液做in vitro kinase assay，取少部分样品跑胶做WB用抗体确定一下蛋白确实被磷酸化了,剩余的大部分样品跑胶考马斯亮蓝染色切条带做MS。