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标题:【求助】双向电泳上样量如何确定

菠萝喵[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】双向电泳上样量如何确定

各位高手，我处理完样品，用Pierce公司的Coomassie(Bradford) Protein Assay Kit测样品的蛋白浓度，之后定上样量，用1mg，再用18cm的IPG胶条跑第一向。结果发现，胶间的点差别很大。所以想请教各位，如何确定双向电泳中的上样量。（图太大，贴不上来！）
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子衿青青[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的图做的挺不错的
但好像你问的如何确定上样量的问题，不是你的主要问题。
如何确定上样量，要根据你的实验目的啊，想总体跑张漂亮的图，象你第一张就挺不错的了
如果是想关注观察其中某部分点，让有些点更清楚，你就要调整上样量，其他点不清楚也无所谓啊。还有看你是用于软件分析还是质谱鉴定等等，目的不同，上样量肯定不同啊
你的问题不是如何确定上样量的问题，而是如何提高重复性的问题。
蛋白质从定量到泡涨到最后下胶到染色
定量不准确，蛋白丢失，染色深浅等有好多因素影响
主要还是从定量和染色找找原因吧，操作也要稳定才行。
顺便帮你把图贴上来


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2014-7-5 17:33
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发表于 2014-7-5 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我现在的问题是要找正常组和诱导组的差异点，从图上看，左边的是正常组，右边的是诱导组，上样都是1mg左右，可跑出来的结果发现正常组的点多于诱导组，而且量也大一些！这样找差异点就很难，因为量不一致！
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子衿青青[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 菠萝喵 于 2014-7-5 17:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我现在的问题是要找正常组和诱导组的差异点，从图上看，左边的是正常组，右边的是诱导组，上样都是1mg左右，可跑出来的结果发现正常组的点多于诱导组，而且量也大一些！这样找差异点就很难，因为量不一致！ ...

是同步跑得同步染色吗？
还是前面说的那些因素
1、有可能你的定量不准吧
2、如果不是同步，操作上的误差
3、即使同步，操作上也可能存在误差，例如加样，吸收情况，平衡过程的蛋白质丢失，二项蛋白质的转移等等。
4、准确定量，或者尽量提高两组定量的一致性、可比性（有时定量本身会误差，但尽量提高两者可比性）
5、操作稳定减少误差
6、软件分析时可以对图的点取VOl％，对于有些点也不是完全不可比，但还是尽量不要用这些图正式比较。
这是我的全部经验，都告诉你了
祝你好运！
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
弱弱的问一句，请问楼主，你是哪里的研究生？因为我也马上要做2-DE，但还不知道到哪里去做！
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changlhsyo[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼主，你做的是细胞诱导蛋白？特别是碱性端还不错，能否给出你的2DE样品处理条件（cqrc_jry@163.com）？我做细胞病毒的，正常组的点也多于病毒组，我想不完全是量和操作的问题吧。
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jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得跟染色程度有关，不好控制的说
不要指望2DE来定量，最多只能大致分析一些差异点，然后进行MS分析
另外，需要多重复几次，统计学意义要考虑进去，
将来发文章也要这方面的数据的～～～～
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发表于 2014-7-5 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

支持子衿青青。最主要的问题可能还是蛋白定量是否准确。
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发表于 2014-7-5 17:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我看了一下，主要是你两块胶的脱色脱得不一样，背景的深度不同，你可以把深的那块再脱一下。还有软件分析胶上点的浓度还是不太可靠，建议还是先用软件找，找用眼睛看来确定。
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summerxx[使用道具]
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 小中大

同意上面几位的意见。我感觉主要还是蛋白定量是否准确地问题，建议你重新定量后，再重复一次；注意每一步操作都要条件一致，准确加样。
Good Luck！
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