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标题:【求助】请问有用细胞培养液的上清做western的吗？

niangao1980[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请问有用细胞培养液的上清做western的吗？


请教给位战友，有用细胞培养液的上清做WESTERN的吗？一般可以检测到多少的蛋白？细胞上清需要特殊的处理么？需要浓缩处理么？如果不浓缩，直接上样可以做出来么？
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mimili_901[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是否能用细胞培养液的上清做WESTERN不能一概而论，主要看所表达蛋白的特性。细胞内表达的蛋白需收集细胞，分泌型蛋白质主要需收集培养上清，也有的分泌型蛋白质可存在于细胞周间隙（细胞膜和细胞壁之间），这还需破壁，此外某些跨膜蛋白质也存在于细胞培养液的上清中。所以是否细胞培养液的上清能做WESTERN主要根据蛋白特性。可以检测到的蛋白的量也要根据蛋白特性和培养条件而定。一般不需要特殊处理，要处理也主要是防止蛋白的降解。是否需要浓缩主要根据蛋白的表达量而定，如果不浓缩，蛋白表达量少的就不容易出结果。不知我是否解释清楚了。
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

上清一般情况下得做浓缩，浓缩方法有两种：一个是三氯乙酸沉淀法，另一个是超滤管离心法，我用第一种方法做了几次都没做出来，可能是我的蛋白量表达太低了，现在正准备试超滤离心，希望对你有帮助，祝你好运！
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niangao1980[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位的帮助，我用WESTERN检测的是一种细胞上清分泌的蛋白，如果用细胞培养液上清做WESTERN，是不是和普通的蛋白一样呢？需要加DTT煮蛋白吗？还是直接上样呢？如何防止蛋白的降解呢？
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sunnyB[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一样的，加DTT煮蛋白
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niangao1980[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
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谢谢各位 战友的帮助，我检测的是肿瘤细胞分泌的一种UPA蛋白，做了几次，杂带都很多，目的条带没有明显的结果。不知道细胞裂解后是否也可以检测出来吗？按照您的说法，除了用细胞的上清外，其余的步骤和一般的蛋白裂解的蛋白一样吗？
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bling[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我在做类似的实验,但是总能检测到tubulin的signal, 因为细胞死后破裂.
有什么好的方法能去除细胞内蛋白的污染吗?
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niangao1980[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问你也是用细胞的培养液上清做western吗？我们可以交流交流么？
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我认为把细胞培养液用超滤管浓缩不失为好的方法，国产的超滤管也不贵，方法也很简单，只要离心就行了，但是要注意超滤管的截留分子量，不要把你的目的蛋白给过滤掉了。提高了蛋白质浓度，你的目的蛋白的含量就相对高了，信号就加强了。当然杂的信号也会相应提高，这就要调整一抗等的浓度来优化条件了
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ritou1985[使用道具]
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发表于 2014-7-5 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也要用上清作，作了一个分子量为45kd的还算顺利，但是分子量25kd的怎么也不行了。
那个蛋白我仅仅用了冻干的浓缩液作的稀释，10ml的上清冻干后用300ul的dd水稀释，煮沸在做的。不过我的上清是无血清的。
盐浓度很高，小分子量根本跑不上来的。
不知道大家都用的是什么公司的超滤柱过的蛋白啊，什么型号的。
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