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标题:【求助】2D出问题了，请高手看图支招

30moonriver[使用道具]
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发表于 2014-7-5 18:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】2D出问题了，请高手看图支招


我用的是安马西雅双向电泳及胶条，杯上样
图1为7CMPH3-10小胶条，尚可
图2、3为18CMPH3-10胶条，点很少，且有如图所示条纹，不知是什么？请高手帮忙


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发表于 2014-7-5 18:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
图22D出问题了，请高手看图支招


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发表于 2014-7-5 18:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

图3 请问是不是样品出问题了，样品是植物细胞的微粒体，-20度保存有3个月了


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 小中大

图确实是掺了点!!!!!我觉得这种结果的原因主要是
1.蛋白的提取出现了问题,有可能是蛋白大量的降解了;
2.不知你的升压的情况怎么样?是否你的盐的浓度有问题,使你的聚焦不完全,以致出现大面积的拖尾和扩散的现象;
建议:蛋白重新提过;样品除盐;确定升压是否异常;胶条的保质期;胶条的保存温度等,在进行实验.
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发表于 2014-7-5 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
升压没有问题，7cm当时跑时可以到6000v,18cm跑时可以到8000v;现在正重提蛋白，请问蛋白大量的降解的可能原因是？
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2014-7-5 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从你的图，可以发现以下问题：
1、蛋白点拉长、聚集在一处，纵拖尾严重
2、蛋白点少
对于1，可增加平衡液中的SDS或者检查聚丙烯酰胺胶配的是否均匀。
对于2，要注意以下几点
a、样品的前处理，蛋白是否降解或提取不完全
b、平衡时间掌握是否可以，一般平衡时间大于10分钟，小于15分钟，时间过长可能会导致蛋白点的丢失。
c、琼脂糖封胶时， IPG胶条是否紧贴聚丙烯酰胺胶面，如果贴的不紧，会导致蛋白点的丢失，而且图会很难看
几点建议，看看是否有用
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发表于 2014-7-5 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能是提取的时候的温度的问题.还有确定你的缓冲液的sds的浓度必须是蛋白浓度的3-4倍.
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发表于 2014-7-5 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们也跑过点很少的图，是由于聚焦不充分造成的，后来改变了聚焦的程序，情况好转了。另外，如果要防止蛋白降解，可以加入蛋白酶的抑制剂。
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2014-7-5 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位，再问一下，图中标出的到底是什么？我自己感觉不像蛋白
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发表于 2014-7-5 18:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
真是长见识啊Big Smile
肯定是样品出问题了，因为一二项都极其不好啊
放3个月确实太久了
但不是主要问题，还是改进一下你的提取方法和纯化方法吧
没做过植物的，但估计纯化处理也很重要。好像你的样品不纯，那圈里的有可能是蛋白质，也可能是杂质？？（不好说）
可以100％肯定是样品的问题，而不单纯是前面战友说的做的过程中的问题。
实在觉得困惑也不自信自己的实验过程，可以用排除法
找点好做的样品，比如细胞提取的蛋白，或者其他的标准品（比如公司的大肠杆菌蛋白质），单纯跑个marker也可以排除二项的一些问题
总之，大家帮你分析只是参考，真正还要自己找原因，
对于2D这复杂的实验，有时不一定看一眼图就能准确说出原因，
有时用排除法是很有用的。
希望您再次提取顺利
另希望您的情况反馈
因为这图实在是太有点意思了Big Smile
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