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标题:【求助】细菌胞内酶的分离纯化

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发表于 2014-7-5 18:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】细菌胞内酶的分离纯化


各位同僚好，我是新手，过去对蛋白质学了解不多，但现在要做细菌包内酶的分离纯化试验，目前头绪很少，请各位高手帮忙指点一下。不胜感激！！！
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发表于 2014-7-5 18:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先你对要提取的酶知道多少信息，比如分子量，等电点，疏水性，等。知道这些就可以选择适合你的酶的纯化方法了。
然后再纯化过程中你要有个检测手段，跟踪酶的活性。这个手段可以告诉你目标蛋白在那个组分，而且应该比较方便快速。
一般纯化步骤就是一系列柱子，先拿到你的粗体液，如果量比较大用硫酸铵沉淀，可以一步除去很多杂蛋白，当然你得确定你的酶不失活。
然后用分子筛，或者离子交换柱，反正纯化没有确定的方法，得看你的蛋白而定。
最重要的是不断跟踪活性。纯化是件有意思的事，要耐心，祝你好运，仅供参考。
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发表于 2014-7-5 18:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对。
先了解酶的性质：分子量、等电点比较重要，可以根据分子量来选择凝胶过滤介质的型号，或者根据等电点选择合适的离子交换介质。如果含有金属离子，可以看看是否可以选择金属螯合亲和层析。以上是纯化的方法，在纯化之前，应离心获得细胞，缓冲液破碎细胞，然后初步浓缩酶，可以用硫酸铵分级沉淀，如果可以还可以用有机溶剂沉淀。纯化比较辛苦，祝好运！
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发表于 2014-7-5 18:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对了，层析前一定要浓缩，可以装在透析袋里用聚乙二醇浓缩。
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 小中大
你好啊！
粗酶溶液如何大概确定其等电点、分子量？另外，细胞破碎后的粗酶溶液可以直接调节到一定体积，用硫酸氨进行分级盐析沉淀吗？
谢谢！
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发表于 2014-7-5 18:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

酶不会是完全未知的吧？查资料获得。如果知道氨基酸数目也可以大概计算分子量，等电点可用纯品作等电点电泳，等电点的目的是用于作离子交换，实在查不到你就阴离子阳离子的层析分别试一试，但填料要花钱买，比较贵。建议先做凝胶获得较纯酶，然后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测量分子量，等点聚焦测量等电点。
凝胶过滤时要注意跟踪酶活。
粗酶液体积不用调节，直接根据表来加入硫酸铵。表生化实验指导上都有。
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发表于 2014-7-5 18:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果　是完全未知的呢　呵呵
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发表于 2014-7-5 18:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
就是完全未知的，那该怎么办呢？
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 小中大

谢谢各位对我的帮助。对于这个酶，我现在是一无所知。目前我在做这个菌的发酵试验，估计过年以后回来就要做酶的纯化。由于我是首次做这个方面的试验，而且原有的蛋白质知识掌握得不多，所以现在头绪很少。
请问，我是不是应该先跑个电泳，确定一下酶的大约的分子量呢？
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发表于 2014-7-5 18:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你最起码应该建立了酶活性的检测方法，对于发酵的产物应该现做硫酸按沉淀，进行初步纯化。
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