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标题:【求助】关于WB，大家帮帮忙！

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发表于 2014-7-5 18:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于WB，大家帮帮忙！

还有个问题，我用5%浓缩胶，6、8、10%的分离胶均跑过，结果MARKER的8条带（6.2KD、16.5KD、25KD、32.5KD、47.5KD、62KD、83KD、175KD）均只能见到6条带，每次跑的时候，MARKER的溴芬兰的兰色还离胶底边足有1厘米远，不知6.2KD的带会比溴芬兰的兰色还跑的远吗，175KD的带能从浓缩胶和分离胶的交界处跑下来吗（担心浓缩胶浓度太大）？我现在不知是小带跑出去了，还是大带没跑下来，所以不知自己目的蛋白的位置，如果能确定175KD能跑下来，那最上一条就是175KD了。
还有一个棘手的问题，我的蛋白是150KD、140KD、130KD。大家有谁知道哪里买得到适合我的蛋白的预染MARKER，我正在用的是50UL，但还要150元，申能博彩的，很不划算，10次就有完，但我翻遍了所有手头的书都找不到合适的，晶美有一种但要950，太贵了，500左右还可以，大家有谁知道哪里有合适的可买，或者谁可以和我合买晶美950元的那种，那更好，我在成都。
期待大家的帮助！
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greenbee[使用道具]
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发表于 2014-7-5 18:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我认为：
1， 175KD的带应该是能跑下来的。除非你配的浓缩胶有问题。
2， 一般MARKER中间有一条带颜色的指示带，可通过这个来确定位置。
3， 溴芬兰大约相当于8～10KD的位置。
4， 一般公司的MARKER都有指示带，国产的也有。
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发表于 2014-7-5 18:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

顶啊，我期待你的实验结果。因为我发现你的PRE-MARKER与我的一摸一样。只是我跑的6％的胶跑不出6条带。只跑出4条。我的蛋白151KD，也不知道你的转膜条件是怎样的 ？
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发表于 2014-7-5 18:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

低于8K的蛋白条带很难在普通SDS-PAGE上电泳显示出来，估计是你那6.2k的条带酶显示出来。
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阿司匹林[使用道具]
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发表于 2014-7-5 18:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我这几天一直在做，我觉得你的151KD的蛋白跑10%就可以，因为我 的也是150KD的，MARKER可以出来明显的7条带，第八条隐约可见，我转膜一般是200MA，3H-3.5H就可以了，不过具体时间还要自己摸，因为其他条件，比如转膜液都会影响转膜效果。
祝：好运
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阿司匹林[使用道具]
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发表于 2014-7-5 18:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.作为漂洗液的PBST中TWEEN-20的浓度多少合适呢，我的是0.05%，可以 吗？
2.抗体用什么配呢，我的是1%蛋白干粉的PBST（浓度和漂洗液的PBST一样）来配的。
3.一抗反应，37度1H；二抗反应，37度1H。
我元旦连续做了4天，问题就在于没有我的目的条带，不知是什么问题，因本教研室没人做过，我也是和别人学了一点，就开始自己摸索，所以很希望得到大家的指点，谢谢！
期盼您的帮助！
还有谁有HSP70和HSP90的抗体，因如买还要等一段时间，所以本人想分一点，按剂量给钱，我在成都，谢谢！
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wsll[使用道具]
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发表于 2014-7-5 18:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们实验室刚买了赛百胜预染的Marker，不过还没开始用，不知道效果如何
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阿司匹林[使用道具]
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发表于 2014-7-5 18:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢大家，我也刚买了赛百胜预染的Marker，用的还可以
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