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1、其实双连并不太容易，要确保能连接上，定向克隆连接正确的比例不高，因此要求感受态菌效率比较高，如此我常是加大连接的质粒量，增加连接时间。
2、如你所说，“培养36小时后，有菌落生长”，这种菌落不值得花时间去验证，多为伴生菌或其他杂菌；转化后如正常时间内无菌落生长，重复比继续等更节约些。
3、可以尝试更换受体菌，DH5a菌种保存时间太长了或保存不当或不适合这种质粒。
4、验证最好不用PCR（除非筛选克隆比较多），你铺板的时候加入的转化质粒常会污染样品（甚至大提，即使你引物设计是针对重组质粒的也常会产生假阳性）。
5、至于是否产生抑制细菌生长的物质，就你结果尚无证据，应该不会。
