【求助】原核表达纯化前的菌液处理问题

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标题:【求助】原核表达纯化前的菌液处理问题

windboy[使用道具]
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发表于 2014-7-5 21:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教各位, 我表达的蛋白带his标签,用的PET32a共95KD,该过镍柱了,但是我现在不知道我表达的蛋白是可溶性的还是包涵体.
1. 能不能直接就按分子克隆上的步骤处理菌液,即: 溶菌酶处理后3000g离心30min,上清过柱? 如果是包涵体的话, 不加尿素溶解,能挂到柱子上么?
2. 还有个问题, 如果不加DNase去除DNA,对纯化有影响么? 超声可以裂解DNA么? 请教各位有经验的战友了,过柱前都怎样破碎细菌才能够比较完全呢? 例如100ml菌液沉淀重悬于5ml PBS中,要多大频率超多久呢? 还需要加溶菌酶处理不?
谢谢各位了!

avi317[使用道具]
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发表于 2014-7-5 21:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1，仅仅加融菌酶是很难破菌的
2，包含体没有裂解不能直接挂柱，有用柱上复性的方法，但并不实用
3，你可以用这个反复超声破菌，上清过柱纯化
湿菌体和缓冲液的重量体积比一般未1：6－1：10
确定合适的超声剂量是关键，一般来说，超声剂量很难有个确定的标准，随菌体冻存情况、重组蛋白表达量、菌株都有关系。一般用大肠杆菌破菌时，适宜采用的参数是400－600 w的功率，超1s，停1s，循环次数500－800次，如果超、停的时间为5s，次数做对应的减少。一般需要通过镜检来观察是否破菌完全，保证冰浴。超声后25000g离心30分钟，然后继续纯化实验。
4，核酸较多的时候会引起超声后溶液粘稠，可以加入核酸酶消化。不加的话，蛋白粗提溶液稀释后也可以上柱，但流速和浓度适当降低。

zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-7-5 21:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我最开做始纯化时是反复冻融裂解细菌，DNA确实会引起溶液粘稠影响过柱。如果不想加DNA酶（只要一点就够了），就硫酸铵盐析一次。不过超声后还有DNA影响纯化的还没遇到。

chengjie79[使用道具]
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发表于 2014-7-5 21:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的是分子克隆上的方法，溶菌酶处理（我不是3000g离心30min，是根据菌体湿重加细胞裂解缓冲液1，PMSF，溶菌酶，脱氧胆酸，接着搅拌），然后用Triton X-100洗涤包涵体，效果不错。不过我在实验中是加了DNA酶1的。

windboy[使用道具]
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发表于 2014-7-5 21:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢楼上几位战友的解答！
我昨天试着超声后离心12000r15min，发现沉淀是黑色的，是不是证明我的蛋白是包含体呢？我将沉淀上清跑电泳，发现沉淀跑出来好像是大部分的全菌蛋白，上清的泳道条带很淡都看不太清楚，我估计是菌液太稀了。

windboy[使用道具]
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发表于 2014-7-5 21:31 资料个人空间短消息加为好友

小中大

“反复超声破菌，上清过柱纯化。超声后25000g离心30分钟，然后继续纯化实验。” 您指的是25000r离心后上清过柱么？这样的离心速度不是会把包含体沉淀下来么？而且我们实验室也没有超高速离心机，最多13200r，真是郁闷阿~

windboy[使用道具]
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发表于 2014-7-5 21:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还有想问一下，过柱前需不需要0。45滤膜过滤，我看有的资料上说包含体大概就是0。5~1。0um，那这样过滤不就损失了包含体么？

fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-7-5 21:32 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你的沉淀是黑色的，也不能说明是包含体。以前做中试的时候，质量好的包含体一般是比较致密、均匀的乳白色，硬度越大成分越纯，－20度冻存后一般是绛红色或褐色。你的沉淀是黑色，是含有很多污染物和杂质的，如果你需要这个包含体的话，还需要按照一定规程用低浓度尿素和tween来洗涤。
至于确定蛋白表达方式，可以在取样的时候，取等量体积，然后高速离心，将上清和沉淀都跑电泳，比较目标条带，才可以确定你的蛋白是包含体还是分泌型的。
一般纯化需要的只是上清中有活性的可溶蛋白，所以沉淀部分和包含体都通过离心去除。之所以高速离心，是充分保证得到的上清中没有不溶的沉淀。一般是需要20000g以上离心才可以。相反，如果只是需要包含体的话，比较低的转速8000g就可以了。

xevin[使用道具]
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发表于 2014-7-5 21:33 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还有想问一下，过柱前需不需要0。45滤膜过滤，我看有的资料上说包含体大概就是0。5~1。0um，那这样过滤不就损失了包含体么？

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过柱的时侯要用尿素或盐酸胍溶解的。

avi317[使用道具]
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发表于 2014-7-5 21:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做的时候，过柱之前先用含有6M尿素的1倍结合缓冲液冰上溶解包涵体，16000g离心半个小时，再过0.45虑膜。