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标题:【求助】关于小分子量蛋白(12~14.4KD)电泳时间问题?

iii_ii[使用道具]
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发表于 2014-7-5 21:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于小分子量蛋白(12~14.4KD)电泳时间问题?


我检测的是小分子量目的蛋白(12~14.4KD),电泳条件:为5%浓缩胶80伏;15%分离胶120伏;时间2.5~4个小时都跑过,但目的蛋白处模糊,不知道是跑出去了还是其他原因,很是困惑,我想问有做过小分子量蛋白,电泳条件和我差不多的各位高手,<<5%浓缩胶80伏;15%分离胶120伏>> 电泳时间究竟多少好?望有经验的朋友帮帮忙!
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发表于 2014-7-5 21:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人经验（1）15%分离胶100伏，溴酚兰线离底部1CM处即可，大约2个小时多一点。（2）目的蛋白模糊可加大上样量或可能与你的样品变性不够充分有关。一般只要溴酚兰线不跑出胶，蛋白不会丢失。
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发表于 2014-7-5 21:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我每孔上25ul,(其实还能上点)我觉的量还可以.上样前在100度的水浴中煮8min我觉的应该变性了啊.还有什么高见?
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jingling845[使用道具]
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发表于 2014-7-5 21:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一点看法：
我目的蛋白21KD，跑的是15％的胶，跑胶条件是浓缩胶跑60V，大约50分钟，分离胶跑120V，大约150分钟。跑胶的效果还可以，MARKER也跑的比较漂亮。鉴于你的蛋白情况，我觉得你完全可以试一下跑18％的分离胶，然后再多试几种电压条件。煮沸8min完全可以使蛋白变性，我觉得上样量不要过大，这样效果反而不好，我个人认为你的目的条带模糊有可能就是由于你的上样量太大造成的，也可能是由于你胶跑的时间太长了。建议楼主将上样量调至20ul甚至更少试一下。
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发表于 2014-7-5 21:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.我的蛋白和你的蛋白分子量差不多，14.4kd，我用的是5％的浓缩胶，15％的分离胶，我跑大胶时（六一的），浓缩胶开始电压为80v,分离胶电压150～200V都行，然后等溴芬兰跑到底部1cm处停止电泳，大概时间在2.5～3h，银染。
2.至于您所说目的蛋白带模糊：不知道是怎么样的模糊？简单分析！
1）条带很好，就是模糊，首先看看你的上样量是不是有问题，我一般5～10微克，既能满足银染，又能满足兰染。
2）条带很好模糊，看看你的染色系统是不是存在问题，优化染色方法。
3）如果说模糊一片的话，很可能样品发生了扩散，按您的条件，电泳时间稍长，你的样品的盐浓度是不是过高；再有你的电极液看看是不是新配置的。
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发表于 2014-7-5 21:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
楼上的战友说:分离胶电压150～200V都行,六一的电泳仪能受的了吗?是否电压过大对电泳仪有损害?
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发表于 2014-7-5 21:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
兄弟，我的片断是13.7kd,用5%的分离胶，15％的分离胶，天能的系统，板大概7cm高，浓缩胶2cm多一点，开始电压为90v,半个小时，分离胶电压110v，然后等溴芬兰跑到底部停止电泳，大概时间在2h，烤蓝染色。染色2个小时，挺漂亮的，6kd的marker 也可以看到。
但是我跑18%的gel时就染色难，也模糊，所以建议你用合适的分离胶，或检查你的配胶的buffer.
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发表于 2014-7-5 21:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我们实验室的，有的为了节约点时间，还有的把电压，调到200v以上，没有出现过问题，我的电泳仪均购自bio-rad。
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发表于 2014-7-5 21:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的蛋白是13KD左右的，现在有了很好的效果：
根据经验，建议：
1、采用tricine电泳13％左右，分离胶中加尿素，或者甘油，可以使条带压缩防止弥散；
2、也可以用加尿素或甘油的SDS电泳。
3、电压最好用恒流来跑！浓缩胶30mA分离胶45mA左右！根据我们实验室经验恒流比恒压会好些，最好能在冰箱中跑!
4、你说的条带模糊，可能是弥散，条带聚集不成一条线，做好的方法是加尿素或者甘油。
5、电泳槽最好用小电泳槽！就是玻璃板7cM高的那种。
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iii_ii[使用道具]
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 小中大

正像楼上的战友说的我今天跑了一板18%的胶; 考蓝染色特别难着色(染2个小时) 且模糊 其实检测小分子量蛋白高浓度的胶好些,但总是出现不是这样就是那样的问题,不知道哪位朋友有用大浓度的胶(>16.5%)来检测小分子量蛋白的经验?
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