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标题:【求助】蛋白质不表达为什么?

泉水叮咚[使用道具]
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发表于 2014-7-5 21:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】蛋白质不表达为什么?


我构建的质粒,表达一个蛋白,可是预试验做了几次都不出结果,详细信息如下:
1.目的片断是1500bp.表达的蛋白约60KD.
2.表达的载体是pGEX-6P-1,含有GST.
3.限制性的内切酶用的是xhoⅠ和EcoRⅠ.
4.根据文献用IPTG在低温下诱导.宿主菌是bl21
5.测序的结果完全正确,没有错配和缺失.
可是结果出来确是没有表达,因为快要毕业了,实在是着急,请大家指点一下!不胜感激
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gmjghh[使用道具]
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发表于 2014-7-5 21:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你说的根据文献是不是说这个蛋白已经有人表达过了？1500bp的片段加上GST后应该在80KD左右。你用的是多少度诱导？多长时间？如果只是看有没表达不需要用低温。你表达这个蛋白的目的是什么？如果是作抗原可分成几段表达。
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泉水叮咚[使用道具]
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发表于 2014-7-5 21:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
文献上报道的是这个蛋白的部分序列表达成功,而我现在要做的全长,我用的是30℃来诱导的,培养液是2×YT含AMP,5个小时以后加入1mm的IPTG,再30℃, 160rpm摇2h后,12000rpm,30s,4℃,离心后用β-ME来裂解.然后做SDS-PAGE,可是结果出来却没有任何的特异性的条带.我表达的目的是为了得到大量的蛋白,作为抗原免疫动物的得到抗体.
请多指教!
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greenbee[使用道具]
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发表于 2014-7-5 21:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

增菌时间太长，诱导时间是不是太短了吧。我用的是37度2.5小时，在诱导3-4小时。你为什么用低温培养呢？
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sunbent[使用道具]
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发表于 2014-7-5 21:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看看哪里是不是有终止子存在.或者在同时换个载体作一下!!
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ffooll[使用道具]
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发表于 2014-7-5 21:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果有终止子的话应该有较小的表达产物存在。既然是打抗体，建议楼主分成几段表达。诱导时间可以长一点。
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quiqui008[使用道具]
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发表于 2014-7-5 21:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的低温是文献上报道的,都是低温,考虑到表达的蛋白的分子量较大,可能是以包含体的形式,为了减少包含体的形成,才用的低温表达,师姐的一个蛋白大约有100多的碱基,和我用的是同样的载体,都表达了.我的载体pGEX-6P-1的多克隆位点的后面没来终止密码子,所以我在设计下游引物的时候加上了TAG的终止密码子而师姐用的是TGA.师姐说是终止密码子的不同导致的比表达,请问这有关系吗?
还请大家多发表意见!谢谢
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发表于 2014-7-5 22:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
为什么不试着多培养些时间，诱导时间也可以延长看看
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u76mp[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也是什么温度浓度时间都试过了,但是就是表达不出来.怎么办啊?毕不了业了!!!555..........
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wanglaoshi[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
重组蛋白表达不是一件容易的事，那现在来讲并不是每种已经知道的序列的蛋白质都能够成功表达出来。每个蛋白乃至片断都是独特的。片断能够成功表达并不代表全长也是如此。其中包括诱导温度，时间，IPTG的浓度以及用于表达的细菌种类和质粒类别等都可能有影响。建议你改变一下IPTG的浓度和诱导时间试一下。如果还是不行，有可能是你用的菌种或质粒不适合表达。因为细菌体内的表达系统可能不适合这种蛋白，比如说缺少或缺失外源蛋白氨基酸的转运RNA等。现在，BL21已经开发出许多亚型，里面加进了一些外源质粒优化外源蛋白表达。你可以咨询一下相关公司。谢谢。
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