【求助】有一些WE的问题，大家帮帮我吧！

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标题:【求助】有一些WE的问题，大家帮帮我吧！

leifengta[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的蛋白150KD，分离胶配多少比较合适呢？
还有我的预染MARKER有8条带，可以根据MARKER来判断我的目的蛋白位置之后再将目的蛋白大概所在的膜截取下来再做下面的呢（我想节约抗体，因为这样膜会小些），但是我今天在园子上看到，SDS-PAGE跑的是蛋白的亚基，所以我就不知道是根据亚基大小还是蛋白的大小（这里是150KD），来判断我的蛋白的位置呢？
预染MARKER使用时，还可以加点LOADINGBUFFER吗？（为了颜色深一些）
由于本实验室条件有限，所以必须到其他实验室提完回来做，我想请教，提好的蛋白是煮完保存还是不煮呢？
期待大家的帮助，我明天就想试一下！

damingxia0904[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你可以试试10%的，我们实验室有做100多的，就用10%的，sds跑的是变性的蛋白，蛋白亚基都已经分开了，所以当然要根据亚基大小判断了，预染MARKER可不可以加LOADINGBUFFER我没试过，你的最后一个问题，如果你的蛋白不需要再定量的话，变性后的蛋白保存时间长，你最好是变性后再带走。

damingxia0904[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不过你最好先试试8%的胶，这个应该更好一些。

wsll[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PAGE电泳有变性胶电泳和非变性胶电泳的，
你可以做非变性胶的，那样就不用将蛋白变性，跑出来的结果就是根据蛋白的大小来判断了。
你的MARKER有8条带，跑的时候要小心些，有时候不一定会有8条带的（不过这种情况比较少，我做蛋白做了3年，也就遇到过几次这种情况），那时候要注意分析了。
根据你的蛋白，用10和12的胶好象都可以跑。实际做做看吧，有时候理论上的东西不一定准的。
be lucky

leifengta[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢各位了！
还有个问题，我用5%浓缩胶，6、8、10%的分离胶均跑过，结果MARKER的8条带（6.2KD、16.5KD、25KD、32.5KD、47.5KD、62KD、83KD、175KD）均只能见到6条带，每次跑的时候，MARKER的溴芬兰的兰色还离胶底边足有1厘米远，不知6.2KD的带会比溴芬兰的兰色还跑的远吗，175KD的带能从浓缩胶和分离胶的交界处跑下来吗（担心浓缩胶浓度太大）？我现在不知是小带跑出去了，还是大带没跑下来，所以不知自己目的蛋白的位置，如果能确定175KD能跑下来，那最上一条就是175KD了。
还有一个棘手的问题，我的蛋白是150KD、140KD、130KD。大家有谁知道哪里买得到适合我的蛋白的预染MARKER，我正在用的是50UL，但还要150元，申能博彩的，很不划算，10次就有完，但我翻遍了所有手头的书都找不到合适的，晶美有一种但要950，太贵了，500左右还可以，大家有谁知道哪里有合适的可买，或者谁可以和我合买晶美950元的那种，那更好，我在成都。
期待大家的帮助！

taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

marker里肯定有些小的带分不开。想看到8条带，跑梯度胶会好些。我觉得大一些的蛋白应该是分开的。
你的蛋白有几个亚基的情况你应该知道啊。
我用的预染marker是生工分装进口的，好像没有那么贵，你问问看。

wanglaoshi[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

SDS-PAGE跑的是蛋白的亚基?
如何这样，如何知道亚基的大小呢？
我们该如何查找目的蛋白的亚基大小？
是不是SDS都是跑的亚基
谢谢

leifengta[使用道具]
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