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标题:【求助】SDS-PAGE遇到的问题

tewank[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】SDS-PAGE遇到的问题


各位大侠，
小妹在跑胶的过程中，发现溴芬兰已经跑到了胶的底部，染色脱色后却发现蛋白条带只跑到分离胶的一半，蛋白全集中分离胶的上半部，而下半部却什么都没有，这是什么原因造成的啊？
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yyaxw84[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我个人认为是您的制样的问题了,一般来说小型的电泳槽没一个点样孔的上样量为20 to 40 micrograms/well.过多的话会不利于蛋白的泳动,造成凝胶的超负荷电泳.
此外,不知道您的各种溶液的PH值调好没有啊!
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tewank[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢！不过我的上样量是10ug/孔，应该不会过量，我取复合一下溶液的pH值吧。
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qqshepherd[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的分离胶浓度过高了
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ffooll[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
偶做的也是，后来老板告诉偶就待溴酚蓝跑出后再多跑一段时间，这个时间长短自己估计，另外分离胶长度可以相对高些，而浓缩胶不要太长，忘有所帮助。
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nn255[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我个人认为 是你的样品的问题，我觉得是不是你的loading buffer 在准备的时候，里边的SDS 没有充分的溶解，你在制备loading buffer的时候 也许是 直接将SDS 粉末加到液体里边，这样肯定不会充分的混匀的。个人觉得 往你的样品中加点 SDS 然后 从新煮沸 ，看看结果怎么样！
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hulu呼噜[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有两种原因：一是分离胶的问题，胶的凝固不好，不利于电场的泳动或胶的浓度过大，导致溴芬蓝指示与蛋白泳动不匹配；二是电泳缓冲液的问题，是不是用的时间过长，pH不对等。
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daod[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:28 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我出现过这样的问题，以前跑的挺好，改进后恢复正常．
１.电泳缓冲液的问题，用的次数过多，缓冲能力下降，尽管有人说缓冲液可用5-6次，可我觉得还是在４次以内为好．
２.严格配置分离胶，做的多了有时就不太仔细，认为反正浓度小点也没问题，可是会是整个体系混乱，特别是ＰＨ．
３.浓缩胶要适合长度，我出问题的时候是浓缩胶过短．
主要的问题在胶的制备，当然样品准备也应按要求来．
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greenbee[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人认为楼主的情况可能是样品没有裂解充分
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gogo[使用道具]
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发表于 2014-7-5 22:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我个人也认为有两个原因：
1.分离胶浓度过高，样品分子比较大，走不下来；
2.分离胶的长度问题
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