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标题:【求助】大半年了，快急死了

qqq111[使用道具]
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发表于 2014-7-7 15:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】大半年了，快急死了


某蛋白，经superdex 75(柱效9000)，单峰；走SDS－PAGE,发现有部分是单体，部分是二聚体，还原电泳全部为单体。不知何故？
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xyw5[使用道具]
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发表于 2014-7-7 15:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

SDS-PAGE就是还原电泳啊，其中的样品缓冲液中有2-ME或DTT，样品跑出来全是单体才对；非还原电泳中倒有可能出现单体和多聚体共存的现象。
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mimili_901[使用道具]
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 小中大

有没有确定这个蛋白有几对二硫键？是表达的重组蛋白吗？你跑得样品是全菌还是抽提的上清呢？
从你的信息来看，感觉头绪有些乱。一般凝胶过滤一个峰，说明只有一个单体活一个二聚体，可以再跑一个还原电泳和非还原电泳，对比来看，确定表达出的到底是单体还是二体。
非还原电泳结果同时有单体和二体是正常的，因为胞内的二硫键折叠酶系会对蛋白的重新折叠进行加工，另外也和蛋白样品、抽提方法、宿主的表达都直接相关。
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zwsyrt[使用道具]
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 小中大

正常，蛋白样品放置一段时间后， 有时候蛋白质中的半胱氨酸残基会相互交联形成二聚体或多聚体，你的蛋白可能就是这种情况，防止这种情况发生的方法是在蛋白质样品中加入低浓度的DTT或巯基乙醇，当然，条件是你的蛋白本身没有二硫键，如果你的蛋白有二硫键，那就无能为力了。
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 小中大

一点分析：
1.还原电泳全部为单体，充分说明了你的蛋白发生了聚合。
2.首先经superdex 75(柱效9000)，单峰，单峰可能是假象，可能纯化这步就没有把聚体与目的真正的分开，建议将您的蛋白做一下SEC-HPLC（柱效与分辨率都能满足），凝胶层析柱要适合你的分子大小.
3.如纯化没问题，就要看看你的样品浓度和储存条件，浓度太高、保存条件不当都会使样品有一定的聚合。
4.再有你的缓冲系统是不是适合你的样品，如果是纯化的问题你就要看看你的纯化条件了（包括层析步骤、选用的介质、缓冲系统、层析条件等）
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 小中大

我的几种蛋白都有二硫键，由于纯化控制的好，样品纯度都大于99％，只是有时有点几的聚体。
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发表于 2014-7-7 15:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

SDS-PAGE包括还原SDS-PAGE和非还原SDS-PAGE 。
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qqq111[使用道具]
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发表于 2014-7-7 15:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
什么是SEC-HPLC?
能详细一点吗？
谢谢！^_^
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orangecake[使用道具]
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 小中大

SEC就是分子排阻色谱，也就是你用superdex 75这样的分子筛
HPLC，是高效液相色谱
不过个人觉得，你的蛋白要是大与50KD的话，就不适宜用HPLC了
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fsdd817[使用道具]
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 小中大
一点分析：
2.首先经superdex 75(柱效9000)，单峰，单峰可能是假象，可能纯化这步就没有把聚体与目的真正的分开，建议将您的蛋白做一下SEC-HPLC（柱效与分辨率都能满足），凝胶层析柱要适合你的分子大小.

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您好，向您请教一下，SEC单峰是假象是什么原因呢？能否具体解释一下。以前接触过一个蛋白，电泳银然一条带，HPLC一单峰，但毛细管凝胶电泳却是双头峰，本来怀疑是蛋白的不同构象，但又无法确认。最后通过纯化工艺达到了检测要求，但还是没有弄清当时的问题所在，您可否指点一些。
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