【求助】非还原条件下的SDS-PAGE

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标题:【求助】非还原条件下的SDS-PAGE

october7[使用道具]
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发表于 2014-7-7 15:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本人实验需要,用到非还原条件下的SDS-PAGE.但有一问题,还请大侠帮忙.
非还原聚丙烯酰胺凝胶的配制、上样缓冲液和电泳缓冲液中都不能含有变性剂如SDS等，上样前样品也不能煮沸，但是在提取蛋白过程中用到的裂解液却含有SDS,不知这里的SDS是否会使蛋白质变性?

avi317[使用道具]
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发表于 2014-7-7 15:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

会
另外，非还原和非变性还是有区别的吧

lxh031[使用道具]
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发表于 2014-7-7 15:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 avi317 于 2014-7-7 15:25 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

会
另外，非还原和非变性还是有区别的吧

谢谢你的回复.
从文献来看,确实有非还原和非变性这两种方法,但具体二者究竟有何本质区别,我确实不知道,还请不吝赐教.

redbutterfly[使用道具]
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发表于 2014-7-7 15:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

变性电泳：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
非变性电泳
当我们研究蛋白质的生物活性，测定天然状态下蛋白质的分子量时，我们必须使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳中蛋白质完全保持了完整的天然状态。在非变性电泳中主要依靠三种因素的作用将蛋白质分开：蛋白质分子的大小、形状和所带电荷。按照分子量大小分离蛋白主要是通过调整凝胶中的丙烯酰胺的浓度来改变凝胶的孔径来实现的。按照核电性质分离蛋白主要的是通过调整电泳缓冲液及凝胶pH值来实现的。一般pH可在3 ～ 11之间进行调整。

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发表于 2014-7-7 15:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.变性电泳一般分为非还原SDS-PAGE和还原SDS-PAGE，还原与非还原的主要区别在于还原SDS-PAGE样品处理液中含有巯基乙醇或DTT等还原性物质。
2.非变性电泳，也就是天然电泳，与变性电泳的主要区别在于无论是样品处理液、凝胶、电极液都不含有破坏蛋白质天然构象的物质，包括也不能沸水煮等，跑出的蛋白带具有活性，保持原有的构象。

bamboo16[使用道具]
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发表于 2014-7-7 15:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

gx128 书写请注意，SDS为十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate），分子式: CH3(CH2)11OSO3Na ，非十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfonate），分子式: CH3(CH2)11SO3Na

october7[使用道具]
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发表于 2014-7-7 15:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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发表于 2014-7-7 15:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

参见宝生物的产品说明书，直接将巯基乙醇或DTT去除即可啊！

is2011[使用道具]
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发表于 2014-7-7 15:29 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢你的回复.
从文献来看,确实有非还原和非变性这两种方法,但具体二者究竟有何本质区别,我确实不知道,还请不吝赐教.

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还原电泳与非还原电泳差别在于处理样品的loading buffer中是否含有巯基乙醇或DTT之类的还原剂，是否将蛋白质的二硫键断裂，形成单体。
变形电泳是指在处理样品时，加入SDS，煮沸过程中，蛋白和SDS按照1:1.4的摩尔比结合，使蛋白形成均一的棒状结构，并充分带负电，电泳过程中，因此蛋白电泳速率只与分子量有关
以往普通的Native PAGE为非还原电泳，没有克服蛋白形状和电荷的影响，电泳速率与多个因素相关。

wmp1234[使用道具]
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发表于 2014-7-7 15:30 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想知道，非还原电泳，由于SDS的存在，是否能够破坏蛋白的聚合体，比如说本来蛋白仅仅是一个二聚体，结果在电泳过程中却出现了二聚体和单体？