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标题:【求助】怎样跑出漂亮的条带？

DNA[使用道具]
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发表于 2014-7-7 15:36 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】怎样跑出漂亮的条带？


分子量8.7kd的蛋白，12%分离胶，4%浓缩胶，pvdf膜，用前甲醇浸泡10秒，电泳电压200v，恒流100mA左右，时间1小时，电转电压100V，电流250-270mA,时间1小时，上样前测蛋白浓度约1mg/ml左右，一抗是进口的，做免疫组化没问题。但最后，只看到marker 的条带，不知什么问题。顺便问问，丽春红染色怎么搞？
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fox_79[使用道具]
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发表于 2014-7-7 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

丽春红配方：
丽春红S 2g
三氯乙酸 30g
磺基水杨酸 30g 加水至100ml，为贮存液。
用1份贮存液加9份去离子水即成丽春红的应用液（《分子克隆》二）。
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发表于 2014-7-7 15:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一点建议：
1.8.7kd的蛋白分子量比较小，因此在跑胶即SDS-PAGE时，应选用浓缩胶5％，分离胶15％或浓度在稍大一点都行，主要为了好控制，使你的蛋白带不至于跑到胶的底部。
2.PVDF膜一定选用0.22的，不然你的蛋白很可能穿透膜，看不到条带。
3.SDS的存在能很大的影响小分子蛋白的转膜，因此甲醇的比例很重要，才能使SDS有效的被去除。
4.跑的胶最好一半银染或兰染，这样可以排除是不是电泳就有问题，还可以确定目的的大概位置，你转膜后，再结合立春红等染色，就能看出是不是转膜存在问题。
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ffaa[使用道具]
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发表于 2014-7-7 15:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的物质是多肽—核苷酸复合物，不知能否用浓缩胶5％，分离胶15％跑，分子量在5000——10000d，另问还有更小的marker吗？
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发表于 2014-7-7 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
分子量在5000——10000d的蛋白，可以用15％分离胶电泳。分子量更小的marker（如9.7KD、6.5KD、4.1KD）可以买到的呀。
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flower-201[使用道具]
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发表于 2014-7-7 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该还会有的！
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mimili_901[使用道具]
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发表于 2014-7-7 15:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

由于蛋白比较小，所以电泳时很容易扩散。建议采用Tricine-SDS-PAGE方法。
分离胶浓度为16.5%（也可以用低浓度的）,浓缩胶浓度为4%。
阳极缓冲液为0.2 mol/L Tris(pH 8.9),
阴极缓冲液为0.1 mol/L Tricine内含0.1%(3.47 mmol/L)SDS和0.1 mol/L Tris(pH 8.25),
凝胶缓冲液为3 mol/L Tris内含0.3%(0.01 mol/L)SDS(pH 8.45)。
Gibco有43~3KDa的marker
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remonte[使用道具]
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发表于 2014-7-7 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你好！问个简单的问题?楼主上面提到的甲醇是干什么用的！
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莲花白[使用道具]
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发表于 2014-7-7 15:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好！问个简单的问题?楼主上面提到的甲醇是干什么用的！

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激活PVDF膜用的
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