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标题:【求助】western blot杂交问题集?

cbou876[使用道具]
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发表于 2014-7-7 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】western blot杂交问题集?


1.为了节约,在一张膜上蛋白分开后, 可否把膜剪切下后按不同分子量蛋白进行杂交显色.
我是新手,希望过来人指点一下.
2.膜与抗体杂交时的容器一般用什么样容器?
3.半干电转时,有没有必要加冰块降温?
4.最后结果分析时,是用分析仪进行灰度分析还是,肉眼判断?
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yueban-1147[使用道具]
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发表于 2014-7-7 16:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.不明白你的意思，如果你想节约，你可以重复用，如PVDF膜，但是你需要有一个很好的膜解吸的方法。
介绍一种解吸液：100mM2-巯基乙醇，2％SDS，62.5mM
Tris-Hcl，pH6.7
PBS缓冲液：10 mM 磷酸盐缓冲液，pH7.2，0.9％ NaCl溶液
封闭液：5％脱脂奶粉PBST溶液
2.封闭的表面皿就行，小一点节省抗体液。
3.半干转一般要求时间比较短，由于其缓冲液在滤纸上，量比较小不适合长时间转移，控制好电流应该不用加冰块，时间在30min左右。
4.关于结果分析就看你做得目的了，一般的鉴别就看看了。
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发表于 2014-7-7 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
关于1补充一下：
如果您是不同分子量的目的蛋白，可以剪开，但要小心不要剪错，可以在转膜后将marker染色做为对照。
将抗体洗脱后再将膜做第二次杂交适用于发光法不适合DAB等沉淀法。而且个人做的结果不如剪开后的好。
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cbou876[使用道具]
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发表于 2014-7-7 16:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
转膜后, 与抗体杂交时可否将膜放在试管中进行?PVDF转膜后有没有正反之分,还是两面都是一样的?
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-7-7 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我一般都把膜放在小的平皿中进行封闭，洗膜，与抗体结合，这样我认为会提高试验的灵敏度，您放在试管里，只要抗体总保持均匀，应该没有问题，不过我还是不习惯您的做法，试管毕竟直径还是小的，膜应该被卷曲了，而且不太方便。至于PVDF转膜后有的站友用光面或毛面（国产的），说法不一，我一般用光面，进口的，应该不存在此问题。
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发表于 2014-7-7 16:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不好意思,再问一下您, 平皿的直径是多大的, 膜稍微弯曲一下应该没关系吧?
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yjf1026[使用道具]
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 小中大

我用的大概是直径8cm的，各种液刚好覆盖膜就行，不过我在生检所看到了更小的，这样肯定更省试剂。 膜稍微弯曲应该没太大问题，只是我还是习惯，不把膜卷曲，这样感觉心里更有底，看习惯了！！
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 小中大
我用的大概是直径8cm的，各种液刚好覆盖膜就行，不过我在生检所看到了更小的，这样肯定更省试剂。 膜稍微弯曲应该没太大问题，只是我还是习惯，不把膜卷曲，这样感觉心里更有底，看习惯了！！

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想要节省抗体最好的办法是用封口机以及一次性手套来做 一般也就2-3ml就够了
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cbou876[使用道具]
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发表于 2014-7-7 16:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这两天在准备电泳器材，我们的电泳仪是伯乐的mini-protean 3 cell,玻璃板是0.75mm,我发现倒胶时两块玻璃板间的距离太窄了,不知各位是用什么工具如何把胶灌进去的?另外薄的玻璃板易脆,有没有便宜的代用品,伯乐的太贵了?请chen老师指点一下,谢谢!
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cbou876[使用道具]
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 小中大
已解决,用枪加和用烧杯直接倒都可以.
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