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标题:【求助】由小鼠腹水中纯化单抗

coolcool[使用道具]
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发表于 2014-7-7 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】由小鼠腹水中纯化单抗

鼠的清蛋白及球蛋白的等电点和疏水性与人的差别大吗？
但我纯化时，可以以人的 等电点和疏水性来做吗？我没找到鼠的具体参数。在哪能查到详细的参数呢？
能提供一些详细的实验方法吗？
我都快被老师逼疯了。
朋友们！！帮帮忙吧
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发表于 2014-7-7 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
疏水性差别很大,通常清蛋白需要1.5-2M硫酸铵才能挂在苯基柱子上,而抗体0.5M就可以,当然不同苯基填料稍微有差别,具体的方法就是0.5M左右硫酸铵上用同种溶液平衡的苯基琼脂糖凝胶柱,然后用缓冲液洗脱就得到抗体,这样方便,便宜,而且条件温和,抗体活性高.等电点沉淀没用过,我觉得过柱子回收率高.
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 小中大

相关疾病：
腹水
我们科里用的是pheryl-sepharose F.F
腹水是直接过柱还是先用50% 硫酸铵沉淀过的？
洗脱时缓冲液用什么好呢？多大浓度？
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 小中大

可以直接加硫酸铵到0.5M左右,也可以沉淀后的样品,缓冲液都可以,20-30mM
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发表于 2014-7-7 17:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
腹水
pH值呢？
我查到腹水中的成分：转铁蛋白等电点5.5
白蛋白等电点4.7
IgG大概在7.2-7.4（这些都是人的 ）
我在纯化时结合时的pH值及洗脱时的pH值有什么要求？
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 小中大

pH7就可以,pheryl-sepharose F.F有高取代和低取代的,我们做实验用的苯基琼脂糖凝胶相当于pheryl-sepharose F.F低取代的,所以如果你的是高取代的,那么可以适当降低硫酸铵的浓度,你自己做实验修正一下即可.
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发表于 2014-7-7 17:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

再问一个弱弱的问题
疏水性与pH值有关吗？
是离等电点越远疏水性越强吗？
高取代或低取代指的是什么？
我也不清楚我们是高 还是低取代？
怎么才能知道？
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 小中大

一般可以不管pH,但是对于你蛋白稳定性而言,pH很关键,所以纯化一定要选择最合适的pH,等电点和疏水关系不大,你的填料后标记LS为低取代,HS为高取代.
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 小中大

butyl-
phenyl-
有什么区别吗？纯化时有什么要特别注意的？
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 小中大

butyl-疏水性比phenyl-弱,所以需要盐浓度高.注意的问题不知道是什么..
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