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标题:【求助】请问BSA液相色谱中流动相条件

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发表于 2014-7-7 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】请问BSA液相色谱中流动相条件


我需要用液相色谱来定量蛋白质，但是这几天做的实验几乎没有出峰，我用40％的乙腈和60% 0.01mol/L H3PO4做流动相，进了一针之后，在20min左右开始出峰，有三个峰，但是后面在进针就没有再出了，反而出现了倒峰，不知道什么原因。（在使用这个色谱条件前几天也用不加酸的流动相做过一次液谱，没有出峰，然后就用90％乙腈－10％水冲柱子了）。
请问有人做过BSA的液谱吗，能告诉我应该选择那些条件吗 ，谢谢各位了，我已经找了好几天的条件了，但就是没有结果。
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发表于 2014-7-7 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我可以给你一点小建议：您的帖子是不是把字体颜色改成黑色呀！！
1.你选用柱子C8、C18都行，0.46*15cm or 25cm，一般用5μm，300埃的。
2.流动相 流动相A：0.1％TFA ，B：0.1％TFA乙腈。
3.色谱条件：室温，214nm检测，然后梯度洗脱，在进样品前做一针样品稀释液，作为对照。通过你上述条件给你一个梯度，20～80％B相，检测时间30min看看效果，上述条件效果不好就用：10～70％B检测时间60min，应该没问题。
4.进样体积一般不超过50μl，蛋白不低于10μg，不高于100μg，但不要太高，10～20μg完全可以满足分辨率。
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发表于 2014-7-7 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢您的建议！呵呵，我这就改成黑色字体！
不过我还想再问得详细些吗？
1.您说的C8、C18柱子是普通的柱子，还是分离蛋白质的专用柱子呢。我现 在用的是分离蛋白质的柱子，C18，25cm,300埃的，应该是可以的吧
2..“ 流动相 流动相A：0.1％TFA ，B：0.1％TFA乙腈。” 中提到的“0.1％TFA乙腈” ，0.1%TFA与乙腈的体积比是多少呢
3.还有我想知道为什么要选择214nm的检测波长呢，蛋白质的特征波长不是280nm吗，我在有些书上也见到用214nm检测的，但是我不是很清楚，还请您赐教。
4.“在进样品前做一针样品稀释液，作为对照” ，要稀释多少倍呢，为什么要稀释呢；如果我现在做的事BSA标准品（纯度是95%），要不要稀释样品呢
又问您这么多问题，还请您能赐教，我真的很想知道，期待您的回复！
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发表于 2014-7-7 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.你的柱子没有问题和我的柱子差不多，一般分离蛋白都用5μm，300埃的，能满足分离BSA的条件。
2.0.1％的TFA，就是1ml的三氟乙酸（色谱级）+999ml的纯水（超纯水、双蒸水都行），0.1％TFA乙腈就是1ml三氟乙酸+999ml乙腈。
3.反相色谱中一般多肽和蛋白在214nm附近有强吸收，也可以215nm，但有的文献上也有用280nm的，但根据我的经验214nm的分辨率远远高于280nm。一般分子筛选用280nm比较多常见的就是PBS缓冲液。
4.样品稀释液就是你溶解样品的缓冲盐溶液不用稀释，作为空白对照，就是为了防止在分析样品时有一些干扰峰，很可能是你的缓冲液本身的峰，这样可以更准确的测定样品的含量或分析纯度。
5.是否稀释BSA标准品，要看你的样品多大浓度了，如果浓度很大，你的样品粘度大，会使定量误差变大，一般你的样品在0.5～1.0mg之间，进样20μl完全能达到你的目的。
6.如果你按我给你的方法得不到满意的结果，等到周一时，我帮你优化一下方法，我手头也有BSA。
7.你也可以采用SEC-HPLC进行定量和纯度分析。
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发表于 2014-7-7 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

说实话，bsa的rpc定量做过一些。
不过，这个蛋白分子量比较大，觉得不大适合。小一点的蛋白比较好。大蛋白收率不会高。以我的实验，不同的样品缓冲液对最终的面积影响很大。定量还是有问题的。不是单单用MOBILE PHASE a稀释样品就可以解决。因为举例TFA和磷酸对于蛋白和固定相的作用强弱的影响是不同的，比较复杂。
除非你的标准曲线的样品和以后方法建立后待分析的样品的条件都完全一致，否则没办法定量。我印象中，差距很大，简直不make sense。
对于BSA，280就可以。如果是DAD就没问题了，不放心的话多设几个波长。
如果没有别的分子量相近蛋白干扰，SEC是比较好的
不知道你是出于什么目的，相用在什么地方。别的方法能不能替代。
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 小中大
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我的目的就是监测蛋白质浓度的变化，一开始时候是用直接紫外光度法做的，但是BSA的浓度变化太小，我没有办法通过紫外观察到浓度的变化，而且紫外需要的量至少得3－4ml，还有一个缺点是蛋白质又爱沉淀（不知道上清液由澄清变成乳白色絮状是不是就是沉淀了，我遇到了这样的问题，因为我不是学生物的，让我很头疼），所以就想换一种方法能够检测BSA，而且用量又可以少些。
如果您有更好的方法和解释，还请指教，谢谢您！
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 小中大

1.如果有分子筛柱，HPLC定量肯定没问题，我有一蛋白是抗原200万分子，定量很准确。
2.再有我得另一蛋白分子量和BSA差不多，反相定量也没问题的。
3.你的标准品溶液的缓冲系统，要和你的样品一样，外标法，做一标准曲线，没有太大问题。
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 小中大
急急：请问C18柱做BSA为何不出峰，柱和流动相条件与chenjinli先生所述相同。
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 小中大

昨天我做样时顺便走了一针BSA，0.1％TFA，和0.1％ 80％的TFA 乙腈水，梯度40-100%B 大概在8min左右就出峰了，就是有一点托尾，我认为优化一下条件或适用一下缓冲盐溶液。因此我的上述条件出峰没有太大问题，再找一下原因。
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jkobn[使用道具]
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 小中大
但我们已做过多种梯度包括您用的梯度，均不出峰。似乎有一个规律：多针BSA未出峰后，做空白，有时会出现不规则的高吸收，该吸收有时持续10几、几十分钟；肯定不是干扰，前后空白都较稳定。色谱系统正常，曾做胰岛素有出峰。我们用的是大连依利特C18柱，难道该柱前有滤膜堵住BSA？已咨询过厂家，不认为柱子有问题，只说应按该蛋白性能摸索流动相条件。我们的柱子有20cm，是否太长？
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