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标题:【求助】有关蛋白质的提取

boom[使用道具]
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发表于 2014-7-7 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】有关蛋白质的提取


各位高人
　　有关蛋白质的提取，有许多种方法，现在国内也有许多公司有提取的试剂盒卖，不知各位现在用的是什么方法，什么方法能最大程度的降低目的蛋白的降解？并且能保证所提取的蛋白浓度和纯度？
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xyw5[使用道具]
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发表于 2014-7-7 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我作真核生物体内表达时用一个启动子(真核特异启动子)能启动三个基因表达吗?谢谢望高手指点
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xyw5[使用道具]
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发表于 2014-7-7 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

根据蛋白的不同表达,蛋白质的提取方法也不同.
通常采用基因工程构建的纯化标记来纯化蛋白,效果较好
它是通过改变 cDNA在被表达的蛋白的氨基端或羧基端加入少许几个额外氨基酸，这个加入的标记可用来作为一个有效的纯化依据。
1．GST融合载体
使要表达的蛋白质和谷胱甘肽S转移酶一起表达，然后利用Glutathione Sepharose 4B作亲和纯化，再利用凝血酶或因子Xa切开。
2.蛋白A融合载体
使要表达的蛋白和蛋白A的IgG结合部位融合在一起表达，以IgG Sepharose纯化。
3.含组氨酸标记（Histidine-tagged）Chelating Sepharose
最通行的标记之一，是在蛋白质的氨基端加上6~10个组氨酸，在一般或变性条件（如8M尿素）下借助它能与Ni2+螯合柱紧紧结合的能力，用咪唑洗脱，或将pH降至5.9使组氨酸充分质子化，不再与结合Ni2+使之得以纯化.
使用试剂盒能保证蛋白有一定的浓度,通常在低温条件下可降低目的蛋白的降解.
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boom[使用道具]
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发表于 2014-7-7 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感谢楼上的
我问的是如何提取蛋白质？
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birdfish[使用道具]
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发表于 2014-7-7 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从组织中提取蛋白要根据组织的不同选择合适的缓冲液，嘿嘿废话，比如我提取的是个酶，条件就很苛刻，要时刻低温而且缓冲液非常温和，通常多次用缓冲液溶解就能把酶溶解出来，降低损失。不同的蛋白提取方法差别很大，所以一般没有通用的试剂盒，要自己摸索提取条件。首先要有个跟踪方法，以确定你的蛋白在那个组分。其次要粗略的定量，以知道你的提取效率。
如果对要提取的蛋白性质有了解，则可以利用其特殊性质富集目的蛋白去除杂蛋白。一般提取蛋白加入蛋白酶抑制剂，来减少降解。几种抑制剂混合使用效果还是很好的。只是又增添了杂质。
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boom[使用道具]
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发表于 2014-7-7 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢
我提取的是EGFR，我想只用loading buffer来提取，不知要注意什么？“首先要有个跟踪方法，以确定你的蛋白在那个组分”您这句话是什么意思？能不能说详细点
谢谢
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yjf1026[使用道具]
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发表于 2014-7-7 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先选择一个灵敏简单的检测目标蛋白的方法，一般来说每一个提纯的步骤都要记录提纯效率的。
降低目标蛋白的降解，需要针对不同的蛋白来确定。蛋白酶抑制剂和低温一般是都要做到的；如果是文献中有报道的，可以参照来做；尽量寻找步骤比较少的protocol.
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boom[使用道具]
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发表于 2014-7-7 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用loading buffer来提取步骤最少，但好象步骤不是低温进行的，相反，是要高温，我很奇怪，这样不是会让蛋白质降解吗？
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发表于 2014-7-7 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的建议是先看看蛋白质纯化鉴定方面的书，对蛋白质纯化有个较清楚的认识。《蛋白质纯化与鉴定实验指南》是本不错的书。里面有从大肠杆菌中提取sigma因子的章节。本版有它的电子版下载。其次查看文献有无已发表的关于你的蛋白的纯化的方法。若没有也可参考相近的蛋白的纯化方法来试试。正如楼上所说，不同蛋白的提取方法差别很大。只能多种方法试着来。
说的全是废话。但我想关于蛋白提取这种大问题不是一两段回帖能阐述了的。还是要自己找书和文献。实验过程的细节拿出来讨论，DXY是个卧虎藏龙的地方，总会有高手能给你解答。
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INK[使用道具]
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发表于 2014-7-7 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我需要从培养的细胞中提取核蛋白，望个位高人给些指点！谢谢
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