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标题:【求助】SDS-PAGE 跑得惨不忍睹,请大家帮忙分析以下原因

wu11998866[使用道具]
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发表于 2014-7-7 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】SDS-PAGE 跑得惨不忍睹,请大家帮忙分析以下原因


如题,谢谢!


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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-7-7 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
蛋白制备可能有问题，因为marker还是可以的。
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2014-7-7 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
降低上样量，上样前充分离心。
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lxh031[使用道具]
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发表于 2014-7-7 18:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
上样量太大了，适当降低上样量。还有感觉上胶好像有问题，建议你检查一下配胶时的操作。
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ending[使用道具]
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 小中大

你的胶从左数第3，5泳道应该没有上样吧。
这种情况最好在这些泳道和没加样的泳道里加满SDSbuffer，防止其他泳道的蛋白往空泳道这边挤；
另外，你加样时可能有些不小心，样品溢到外面来了，污染了周围泳道，因为Marker右边的泳道似乎也有带了；
还有，电泳缓冲液如果用2次以上就会出现许多横的纵的条纹背景，不容易脱干净，感觉你这块胶就象这种情况。
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ending[使用道具]
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发表于 2014-7-7 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的SDS-PAGE前处理步骤：（提供给新手，也希望得到高手的指点）
1 样品从冰箱里拿出，融解，振荡使一些沉淀析出的蛋白重新溶解；
2 充分离心，去除可能存在的小的不溶颗粒；
3 安装样品的浓度加20ug蛋白（要先定量的），用1×SDSbuffer补总体积到25ul；
4 沸水浴7min；
5 离心1min，使水浴时蒸发凝结在离心管壁和盖上的溶液重新回到管底；
（此步骤很重要，不然加样时溶液体积都不够，而已量也不同）
6 加样
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lxh031[使用道具]
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发表于 2014-7-7 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问第二步充分离心要多大转数及多长时间呢？我一般12000rpm，离心15-20分钟，是不是有些过分呢？
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ha111[使用道具]
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发表于 2014-7-7 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

12000rpm 1min
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moonlight45[使用道具]
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发表于 2014-7-7 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最主要的原因就是蛋白量太大了.和本人前两天所做的几乎一样,结果把蛋白上样量降低了十倍后,结果就明显改善了.
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duoduo[使用道具]
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发表于 2014-7-7 18:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我认为，你上样的时候，不要有空的孔，煮过以后要13000离心至少5分钟。
另外你的样品中的盐份也不均一，从而出现积压的现象，
如果你的胶是银染的话，有点过了
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