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标题:【求助】做一个1.8k的基因构建BL21工程菌表达的蛋白好像...

xevin[使用道具]
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发表于 2014-7-8 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】做一个1.8k的基因构建BL21工程菌表达的蛋白好像...


我在pet28a插入一个1.8k基因，然后构建BL21（DE3）重组菌，表达，SDS-PAGE有30％左右的总蛋白表达量。这个外源蛋白是一个酶，最重要的是我要得到有酶活的蛋白。
然后超声破碎细胞，分别将上清和沉淀SDS-PAGE，发现表达蛋白几乎都是包涵体。不甘心，分别将上清和沉淀测酶活，上清没有酶活，沉淀似乎有一点活性？！
大家做类似工作的，觉得这有可能吗？包涵体有一点活性。下一步的复性不知道好做吗？？
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-7-8 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

”沉淀似乎有一点活性？！”是什么意思？难道是直接将破菌沉淀加入测活体系？
我觉得应该先将包涵体纯化后再尝试复性，最后取复性上清测酶活。
pet28a表达的蛋白应该带有His-Tag，包涵体用尿素或盐酸胍溶解后，可以用Ni柱进行亲和纯化，然后尝试进行透析复性或稀释复性。
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发表于 2014-7-8 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也遇到了这样的问题！郁闷！提醒一下，复性，对每个蛋白来说最佳条件都不样，而且效率很低。 楼主还是试试别的方法先吧！
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DNA[使用道具]
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 小中大

我觉得还是操作上的,蛋白表达出来一点不可溶?或许我是lucker?我没碰到一个呢,仔细研究一下你提蛋白的方法,应该是会有可溶性的.
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hyuu[使用道具]
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发表于 2014-7-8 10:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还可以改变一下你的表达条件,比如诱导温度.时间,诱导剂浓度等等,是不是有非包含体蛋白产生?
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TAT[使用道具]
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发表于 2014-7-8 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

同意楼上的观点，表达条件尤其是温度对于包涵体的产生很关键，试试低温诱导，另外破菌方法也很重要，用溶菌酶可能会好些。
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-7-8 10:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

祝楼主好运，我做的蛋白，温度都降到16度了，IPTG从0.01mM到1mM试过N次了，就是不行。准备换带导肽的质粒（听说有助于蛋白正确折叠），但是在下没有这种载体，不知哪位大侠能帮这个大忙。
另外，还想征求一下各位的意见，真核表达怎样，在下从来没作过，只是有一点点这方面的想法。
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-7-8 10:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

另外听说有带共表达分子伴侣的质粒，没见过，不知在座各位是否有此类物质。能否奉献一下，以解我们的燃眉之急。
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2014-7-8 10:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

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原来我也不信这个邪，我以前表达过至少六七个蛋白都很顺利，这次就在这里给卡住了，载体菌株也都试过好几种，温度什么的就跟不用说了。最近两个月，经常因为这个失眠。
都准备换真核表达了，可是听人说那个也不好作，更何况我这样以前没做过的。而且，留给我的时间也不多了，6月份该毕业了，郁闷啦！
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dog002[使用道具]
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发表于 2014-7-8 10:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
，有些蛋白怎么表达都是包含体。
不知道pet28质粒是否可进行融合表达，否则你可以换融合thioredoxin或GST等的质粒，这些质粒都比较好找吧。
若做真核表达，一般时间比较长。
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