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标题:【求助】原核表达问题

小荷尖尖[使用道具]
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发表于 2014-7-8 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】原核表达问题

我将目的基因与表达载体重组后，经测序鉴定已正确连接，但是却表达不出目的蛋白，诱导条件IPTG浓度从0.1-1.0mM，时间从3h-10h,温度从25-34度都摸索过，但是诱导前后没有差别，我的目的蛋白是50kD，会是什么原因呢？是不是我的目的序列翻译起始效率太低了？有办法解决吗？
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DNA[使用道具]
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发表于 2014-7-8 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

"经测序鉴定已正确连接",正确连接还不够,得看阅读框正不正确!
如果已经排除建议做过纯化,我以前出现过诱导前后无明显差异,但纯化后就出现了目的条带,因为有时间表达量确定很低,分辨不出来,但纯化(用标签)就可以将之分辨出来.建议试试
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fsdd817[使用道具]
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发表于 2014-7-8 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

"经测序鉴定已正确连接",估计你的阅读框也应该没弄错，除非是你设计的时候就搞错了。
50KD的蛋白很好表达的，当然很容易形成包涵体。
还有一个问题就是你的SD序列可能没有，或者不合理，或者被其它二级结构给掩埋掉了，这样是几乎没有表达的。我的建议就是仔细检查一下你所构建的载体的启动子下游中的SD序列，看看是不是在你插入表达基因时被切掉了，或是能和你的序列形成二级结构。
祝成功！：）
A za a za fighting！
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小荷尖尖[使用道具]
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 小中大
谢谢解答！我没太说明白，我的载体的标签蛋白很大50kD，我的目的蛋白只有16个AA，所以整个融合蛋白是50kD左右，空载体经诱导出现标签蛋白的大量表达，我的目的蛋白是接在标签的N端，而且经过核查SD序列存在，什么原因会表达不出来呢？
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小荷尖尖[使用道具]
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发表于 2014-7-8 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
读码框是正确的阿！！
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taoshengyijiu[使用道具]
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发表于 2014-7-8 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
看看你的序列里有没有大肠杆菌的稀有密码子，大肠杆菌里缺乏某些tRNA，会导致你的目的蛋白不表达。
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小荷尖尖[使用道具]
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发表于 2014-7-8 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

相关疾病：
头痛
我的目的基因是人工合成的，选择的是大肠杆菌偏爱的密码子，可就是标大不出来，真是很让人头疼！
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huifeng0516[使用道具]
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发表于 2014-7-8 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

maybe ,you can use another clony, I have met this kind of problem.I select 8 clony, there are only 6 can express the protein.Are you using the pMAL vector?
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junhun[使用道具]
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发表于 2014-7-8 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
建议楼主将实验的某些细节，比如什么载体，什么表达菌，目的蛋白有无毒性等等说一下，按楼主描述的似乎该考虑的都考虑到了，应该是能表达的，但目前不工作，看看是不是什么小地方出纰漏了
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vera+[使用道具]
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发表于 2014-7-8 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

建议你先做个western，看一下目的蛋白到底有没有表达，或许是量比较小。如果确定有表达，那再研究优化方案。如果没有表达，那换下载体或者菌株试试。 我前阵就表达了一个蛋白，量很小，电泳看对照在目标分子量处也有一条带，后来做WB证实有表达，就是量小的很。 你可以先试试！
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