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标题:【求助】免疫共沉淀怎么做?

popo520[使用道具]
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【求助】免疫共沉淀怎么做?


各位好,我最近想做一个两联复合物, 文献说要球免疫共沉淀 =、连续免疫沉淀,请问这和一般的免疫沉淀又什么不同。 多谢指点。
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youyou99[使用道具]
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免疫共沉淀 前面步骤与免疫沉淀相同,只是在跑完SDS-PAGE后,做一个WB,用感兴趣的蛋白的抗体来检测感兴趣的蛋白与目的蛋白相互作用。建议看一下《抗体技术实验指南》非常有用
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popo520[使用道具]
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谢谢 你的,因为我做的两个是符合物,是不是我最后加抗体时同时加进去, 这样就可以显出两个条带,对吗?
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kuaizige[使用道具]
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不是这样子的。
这个复合物中的两个蛋白的抗体你应该是有的了,那么你应该用这两个抗体分别作免疫共沉淀,对沉淀下的复合物分别再用另外一种抗体去检测(western),如果两者可以互相检测的到,说明你这两个蛋白处于同一个复合物中。只是不知你这两个蛋白是天然存在于组织中还是人工转染表达的,如果是后者则这种方法的结果一般可信度不高;而如果是前者,那么恭喜,如果做出来,结果是毫无疑问的。
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popo520[使用道具]
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回复 #4 kuaizige 的帖子

是天然的, 我看到文献在一个图象中,两条代都有。如果我加一种抗体,应该出来一个蛋白的条带吧。莫非加一个抗体,会同时出现两个条带吗/。多谢
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greenbee[使用道具]
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你确定文献中是western检测到的2条带吗?免疫沉淀下的东西SDS-PAGE也是可以看得到的。
如果确定是western检测的,那就可能是如你前所说的,加了两种抗体同时进行了检测,但这样子做可能会产生非特异(交叉反应)。我曾经做过同时将鼠源(单抗)和兔源(多抗)的一抗同时加入孵育,效果很不好,出了很多非特异带。可能,抗体顺序加入或许会好点,你可以试试。
其实,稳妥的办法(我个人认为也是标准的,呵呵)就应该是我前面所说的,用两种抗体沉淀下的复合物分别跑两个电泳,再用两种抗体分别检测。具体如下:
第一块胶:
A抗体沉淀复合物、A抗体沉淀后上清、B抗体沉淀复合物、 A抗体沉淀后上清。SDS-PAGE后用A抗体检测。
第二块胶:
同样的样品,用B抗体检测。
呵呵,仅仅是我的看法,希望对你有用。
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popo520[使用道具]
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文献 上说,用持续免疫沉淀,这个怎么做?加抗体时间间隔时间多少?
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greenbee[使用道具]
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回复 #7 popo520 的帖子

最好把文献拿出来
说实话,我没听说过持续免疫沉淀。
你做免疫沉淀的目的是什么?
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上海丰核[使用道具]
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回复 #1 popo520 的帖子

楼上正解
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silent003[使用道具]
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全自动特定蛋白分析仪测定原理是通过检测悬浮于缓冲液中的抗原与相应抗体发生反应,在抗体过量的前提下,形成免疫复合物颗粒。光源采用双光源碘化硅晶灯泡。有光束通过时,悬浮颗粒所产生的散射光速率变化强弱与抗原浓度成正比,在反应达到最高峰时测定产物形成的量,速率峰值的高低与抗原含量成比例。此测定法称为速率散射比浊法。然后速率峰值经微机处理转换成被测抗原浓度。因此获取正确的速率信号是系统测定技术的关键。在检测标本时,散射光信号的变化分3个阶段:第一阶段的散射光信号是由缓冲液产生的。第二阶段的散射光信号是由加入稀释的抗原后出现略微增强的信号。最后加人抗体,形成免疫复合物颗粒,出现第三阶段明显逐渐增强的信号变化,直到反应达到终点。 仪器将反应初期之前的本底信号调成速率值等于0,然后随着抗原--抗体结合反应的进行,速率信号的增强逐渐加快,最后达到峰值。一旦所需的速率峰值测到以后,仪器还通过峰值鉴定程序再对峰值进行确证,以排除因污染颗粒、气泡及非特异性沉淀物引起的于扰性散射光信号。
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