小中大各位前辈,我最近在跑分子量大约在230kd的蛋白,用的6%的SDS-page的胶,80V跑2-3小时,200mA转膜3.5h,一抗用5%BSA稀释1:1000,4°孵育过夜,二抗1:2000牛奶稀释,孵育1小时,TBST洗膜三次,每次10分钟,结果膜上一点痕迹都没有,求助各位大侠,跑230kd的蛋白有什么技巧吗?
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western的几个问题:
1. postive control
你是否确定你的样品里面有230kd的这个蛋白表达?比如说过表达的样品。我相信你没有。
你是否确定你的抗体是好的?比如过表达一个flag tag的,然后看flag能否杂出来。
确定之后再来做trouble shooting