药物分析

　　摘要：用薄层色谱(TLC、)高效液相色谱-光电二管阵列检测器(HPLC/DAD)、动物实验等方法对生物检材中乌头生物碱进行，并对这些方法进行比较。结果发现，TLC法为此类药物检验筛选的首选方法，最小检出量为0.3μg。在进行 HPLC检测时，以乌头生物碱的特征紫外吸收光谱和动物实验结果为重要的定性手段，其特征吸收波长为(228±2)nm和275±2)nm。乌头生物碱在 2g/L~50MG/l时其色谱峰面积与质量浓度有很好的线形，想国系数为0.9996。经实际案件证明，方法准确、灵敏，可用于生物检材中乌头类生物碱的检验。

　　关键词：薄层色谱;高效液相色谱'乌头生物碱;动物实验

　　中图分类号：O658 文献标识码：A 文章编号：1000-8713(2002)01-03

　　乌头生物碱是一类常见的毒性强烈的毒物。它种类繁多，结构复杂，稳定性差，其有效成分及毒性随产地、季节、炮制方法不同而呈现较大的差异。在我国，乌头生物碱中毒的案件时有发生，尤其在中药炮制中服用过量及误服事件更为常见。在这类案件的实际检验中，较多的是对有毒植物及可疑药物进行检验，而对生物检材中乌头生物碱的检验少有报道。通过高效液相-光电二极管阵列检测器(HPLC/DAD)法及动物实验方法进行检验更为少见。笔者在几起死因不明而怀疑为乌头碱中毒案件中，分别对可以药物及死者胃内容物、肝脏进行检验，取得了较好的结果。

　　1　实验部分

　　1.1　仪器与试剂

　　高效薄层板(GF254(青岛海洋化工厂);离心机，转速为4000r/min(上海手术器械厂);高效液相色谱仪HP-1100 HPLC，带DAD(美国惠普公司)。

　　空白肝脏(取自乙醇中毒死亡案件的死者);实验用鼠为15g~20g小白鼠，两周龄。

　　试剂：甲醇、乙腈为色谱纯;氯仿、无水乙醇、无水硫酸钠、冰醋酸、盐酸，均为分析纯;去离子水。乌头生物碱对照品(购自中国药品生物制品检定所)。

　　乌头生物碱标准溶液(100mg/L)：精确称取乌头生物碱对照品10mg溶于100ml无水甲醇中。碘化铋钾：取次硝酸铋200mg、碘化钾 5g、碘2g、浓盐酸1ml和冰醋酸1ml，加水溶解，稀释至250ml，置于冰箱内保存。

　　1.2　检材提取

　　取死者胃内容物5ml, 离心5min。取上清液调PH为8~9，用氯仿提取、无水硫酸钠脱水，置于60℃下KD浓缩器中挥干，备检。

　　取研碎的死者肝10g，加入2mol/L Hcl 20ml，在80℃水解2h，冷却，离心。取上清液调PH为8~9，用氯仿提取、无水硫酸钠脱水，在80℃下挥干，备检。空白肝脏的提取同上等量平行操作。

　　取可疑药物5g ，用15ml无水乙醇浸泡 24h，离心，取上清液挥干，备检。

　　1.3　检验

　　1.3.1　薄层色谱法(TLC)检验

　　吸附剂：硅胶G;展开剂：A为环己烷-二乙胺(体积比为9：1)溶液，B为环己烷-乙酸乙酯(体积比为1：1)溶液，C为苯-二氧六环-二乙胺(体积比为7：2：1)溶液;显色剂：碘化铋钾;

　　将上述检材提取物分别用甲醇200μl溶解，进行TLC分析。展开后将展开剂挥干，放入碘化铋钾显色3s，取出观察。

　　1.3.2　HPLC分析

　　色谱柱：1 Phenosphere CN 5μm(250mmx4.6mm ID);2 Pypersil 5μm C18 BDB(250mmx4.6mm ID).流动相 A：0.001mol/L KH2PO4+0.001mol/L 十二烷基磺酸钠; B：5%乙腈;C：甲醇。流动相梯度0min~10min, V(A):V(B):V(C)=65:5:30; 10min~20min,V(A):V(B):V(C)=40:14:46; 20min~25min. V(A):V(C)=15:85; 25min, V(A):V(B):V(C)=44:10:46.

　　取上述检材提取物分别用甲醇200μL溶解，取20μL进行HPLC分心。

　　1.3.3　标准工作曲线

　　配制乌头标准溶液2mg/L, 5mg/L,10mg/L,30mg/L,50mg/L,80mg/L, 100mg/L进行HPLC分析，以其峰面积Y对质量浓度X(mg/L)作标准工作曲线，得线性方程Y=-0.2805908+14.11653XM, r=0.9996 线性范围2mg/L~50mg/L。

　　1.3.4　动物实验

　　毒饵配制(按不同提取法分为3组)：

　　第一组 取可疑药物5g，置于10ml水中浸泡24，挥至3，备用。

　　第二组 取可以药物5g，置于10ml 1%乙酸红加热浸泡24h，挥至3mL，备用。

　　第三组 取可疑药物5g，置于15ml无水乙醇中加热浸泡24h，挥干，再用5ml 1%盐酸溶解，加碱至中性，浓缩至3ml备用。

　　取小白鼠9只，平均分为3组，禁食12h后，分别向各组白鼠胃中注入对应组别可疑药物提取液各1ml/只，结果第1，3组白鼠中毒死亡。

　　2　结果与讨论

　　(1)在几起案件中，我们首先用TLC对乌头生物碱进行检验。结果表明，TLC法简便易行，灵敏度高，最小检出量为0.3μg，可作为乌头生物碱检验筛选的首选方法。如果显色结果呈阴性，可作为否定此类药物存在的依据。

　　(2)由于乌头生物碱的种类繁多、结构复杂、化学稳定性差，故相同检材的不同提取处理方法得到的结果有较大差异。这一点，在TLC和HPLC 检验中表现得非常明显。不仅检材的Rf 值及tR值与标准乌头生物碱的Rf值及tR值难以吻合，甚至标准乌头生物碱由于产地不同、保存时间不同，其Rf值及tR 值也不尽相同。显然，不能依据Rf值及tR值对乌头生物碱定性。同时我们也发现，虽然HPLC检验中乌头类生物碱tR值变化复杂，难以控制和掌握，但其特定结构基团在紫外检测中的吸收波长比较稳定，峰形特征明显，特征吸收波长为(228±2)nm,(275±2)nm,且不随其tR变化而变化。经与检材肝脏腐败程度相当的正常肝脏的对照检验证实，肝组织中的内源性物质对检验没有干扰，故可作为乌头生物碱定性的重要依据。在我们的实验中，从中毒死者肝脏及胃内容物中均检测出乌头类生物碱成分，分离情况良好，吸收波长稳定，紫外吸收光谱特征明显。尤其在肝脏中检测出乌头碱成分更有着重要的意义。

　　(3)据文献介绍，乌头类生物碱中毒性最强的是乌头碱、中乌头碱、次乌头碱等双酯型生物碱。这类药物亲酯性强、毒性大，人口服4mg即可死亡。但在药物炮制、加工过程中，这类药物容易水解，失去苯甲酰基团，生成乙酰乌头碱，其毒性明显降低;再进一步水解，生成乙酰胺类物质，毒性进一步降低。这一观点在动物实验中的得到了体现，。用可疑药物色稀乙酸浸泡灌喂白鼠，白鼠未见死亡;而用同等重量可疑的水和乙醇提取液灌喂白鼠，受试白鼠全部死亡。可见，药物提取方法不同，即水解程度的不同，其毒性表现出明显的差异，这一特点显著区别于其他药物。

　　(4)据文献介绍，乌头生物碱的毒害作用主要作用于人、畜的心脏和神经系统，使其心率时常，周围神经先兴奋后抑制，甚至麻痹。我们的动物实验直观地再现了这一现象，中毒白鼠开始表现兴奋、躁动;随即产生麻木现象，行走困难，四肢无力，难以支撑身体;最后，四肢瘫痪，呈俯卧状死亡。此中毒症状特征明显、直观，与其他毒物中毒症状有明显的区别。此动物实验结果可作为乌头生物碱检验的一个重要依据和旁证。

　　(5)由于乌头生物碱种类繁多，有毒成分热稳定性差，且不一汽化，因此难以用常规的GC和GC/MS方法分析，在缺乏LC/MS 等检测条件下的定性比较困难。由于我们对生物碱各有效成分在体内的变化规律尚未弄清，故在检验中未进行具体定量分析，知识使用两根色谱柱(C18柱及CN 柱)与DAD光谱图相结合进行了定性分析。