核磁共振

15N标记蛋白做三维实验前应做哪些实验准备

本人以前是做多肽结构的，现有一90残基的15N标记蛋白想测结构，有些问题想请教做过的各位大师，请好心人指点，谢谢！

问题1：核磁共振前期准备工作应做哪些？我现在知道的有以下几个，不知是否必要，
1. 蛋白样品的1H90度（是否需要用zgpr压水）
2.15N的90度
3.1H-15N HSQC（是否必须？）

问题2：只是15N标记，要测的三维实验有哪些，我知道的有：15N-TOCSY,15N-NOESY,不知是否还需测HNHA,HNHB,我用CYANA算结构

问题3：我的样品浓度能到1.5mM，不知ns设多少合适，一个三维实验大概需要多长时间?

问题1：
1） 是
2） 是
3） 是

问题2，只有15N，1H的信息算结构有些困难。不过前不久有篇JACS paper直接用NOE预测3D结构。

问题3，这个浓度不错，你的蛋白也不大，大概一、两天，根据你的仪器而定。

谢谢您的回答，我的仪器是bruker600，没有超低温探头，因为13C标记太贵，所以只能先试试了。不知道用不用测偶合常数，我只有CYANA，以前没用到偶合常数

估计你还没有对HSQC进行归属吧。
那么对于H的归属就更难了。
即使得到这些J耦合信息，也用处不大。

再请教一个问题，15N-TOCSY,15N-NOESY一般用哪个pulse program比较好啊，估计我的样品需要压水峰，谢谢

(1). 高浓度蛋白有没有聚集？可以测测迟豫
(2). 90aa不知道N15-TOCSY还能work?
(3). 蛋白能做高温吗？大于40度？
(4). 能看一看1D和hsqc吗？--谱峰分散的如何
(5). 有同源结构吗，是啥类型的？a-helix,beta-sheet?
(6). 可以做做rdc，如果能指认主链的话

15天，感觉需要超级高的效率...

如果不出错的话，15天差不多。
不过优化参数要花些时间。

15天是收集一套3D的时间吧，不过，鉴于楼主的蛋白浓度比较高，可能会降低到7天，但是这都是理想条件。
但是，楼主的什么条件都没有摸过，核磁的buffer，比如用什么样的pH，什么样的还原剂等，温度等，都不知道，强烈怀疑15天能足够，而且解谱估计也很困难，很想知道在没有C的情况下楼主怎么样归属这些峰

如果蛋白足够好，可能没有聚集，一个同事都2mM了，还是Monomer，超级稳定，
不过你能具体说说做怎么样的rdc么？能给一篇文章的链接么？