PCR仪

首先谢谢你的回答 我的引物是刚刚设计的，BLAST后效果很好的，这条引物是从牛津大学的引物库中引用的，应该信得过，另外我做了电泳，目的基因142bp没有出来，倒是出来了两条非特异带,内参基因还可以，就是融解曲线不行，咋办？如何继续摸索呢，提高退火温度吗 那内参咋办呢以前做的内参就是这个退火温度，效果要比这个好的多，不知道为何，现在融解曲线不能用了

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你的扩增产物目的条带没有出来，我想提高退火温度还是出不来的。所以我感觉还是出现在引物这个环节上。

我做荧光定量PCR已经快半年了，但是有一个问题一直无法解决，望大虾指教，多谢。问题是：标准品是qiagen试剂盒提的质粒，紫外分光光度仪进行核酸定量，计算出拷贝数/ul，然后10倍倍比稀释，从10*8~10*1/ul作为各梯度的标准品。
反映体系20ul，模板2ul。10*3、10*2、10*1及阴性对照，曲线几乎重合，无法分开。10*8~10*4的线性关系都很好，r值为1.7。
方法尝试过taqman和SYBR GREEN，都没法解决这个问题。
问题可能出在哪里？先谢谢了。

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每个仪器都有一定的检测限，不知道是不是你这个仪器的检测限比较差一些。建议你问一下仪器厂商的技术支持。

大侠：我现在正做荧光定量PCR，想请教几个问题
1。我以表达某个基因阴性的细胞序列稀释表达阳性的细胞，抽提RNA、RT、real-time PCR,怎样才能确定检测的敏感度呢？要不要做统计？
2。内参的该怎样选择？有必要同时做内参的标准曲线吗？

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谢谢！
第1个问题不是很明白，请重述。
2内参基因是选择一些在细胞中表达比较稳定，且表达丰度比较高的基因作为内参基因。比如beta actin。

请教引物的问题，谢谢解答！
我做的细菌是放线菌，粘性放线菌和内氏放线菌是我们实验室做的最多的，因此有标准菌，但是我的实验中还包括一些其他种类的放线菌，实验室里面并没有标准菌，我在genebank上下载到了这些放线菌的基因序列，并设计出来了引物，本来应该用标准菌检测一下引物的特异性的，但是如前面所述，没有标准菌，请问还有没有方法可以检查引物的特异性，比如在pubmed上有blast打分，能不能检测特异性，会不会得到公认？万分感谢！

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引物设计最后应该blast一下。你想确认一下特异性，除了BLAST，还可以用你的非标准菌直接用PCR扩增，然后跑电泳看看是否有非特异性条带。建议两者结合一下。

每个仪器都有一定的检测限，不知道是不是你这个仪器的检测限比较差一些。建议你问一下仪器厂商的技术支持。

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我做荧光定量PCR已经快半年了，但是有一个问题一直无法解决，望大虾指教，多谢。问题是：标准品是qiagen试剂盒提的质粒，紫外分光光度仪进行核酸定量，计算出拷贝数/ul，然后10倍倍比稀释，从10*8~10*1/ul作为各梯度的标准品。
反映体系20ul，模板2ul。10*3、10*2、10*1及阴性对照，曲线几乎重合，无法分开。10*8~10*4的线性关系都很好，r值为1.7。
方法尝试过taqman和SYBR GREEN，都没法解决这个问题。
问题可能出在哪里？先谢谢了。

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您好，我也遇到了和an1212战友相似的问题，10*4Ct值只有28左右，后面再稀释就不出现起跳了。我的机子可以检测到35个循环以上。请问这是什么原因？

你好，有个困扰我的问题想问下．

我用Ｔaqman探针，阴性（空体系）上机时也会出现很好的扩增曲线，大约８个里总会长１～２个，这应该不是试剂污染，可能是什么原因呢？

还有，
有时做灵敏度测定，空体系有扩增，而低浓度反而不长，实在很怪．

盼解答！

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应该是污染，但应该不是试剂污染，而很有可能是你的仪器上有PCR产物，在运行的时候会产生气融胶，跑到管子中去，建议和仪器厂商的联系，看怎么清洗一下仪器。还有可能是你在操作过程中是否会操作不当，带入一些模板到阴性管中去呢？