PCR仪

real－time PCR 即定量PCR？

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是的

曾将PCr结果上传到论坛请教，园友认为曲线可（见：cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&amp');id=6916908&sty=1）
样本跑得差不多了，看试剂还多就把有些样本重跑了一次，发现两次的结果相差太大。
1。我用的看家基因作为内对照，进行相对定量（delta delta CT法），delta CT=（CT目的基因）—（CT看家基因), 通过统计比较病例组与正常组的delta CT，检测目的基因在病例组与正常组的表达差异
2。每个样本均有3个平行孔重复，即每样本的目的基因同时做3个，看家基因同时做3个，实验结果显示3个平行孔Ct值一致性很好，后来重复做的样本平行孔德一致性也好，就是两次间的差异太大，反应条件完全一样啊。
3。如果目的基因表达有变化，如降低，那么在统计时，病例组的delta CT是应该比正常组高还是低啊。
一头雾水，拜托赐教！！

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2、你是从RNA反转录开始做还是从cDNA开始做，如果从RNA开始做，可以考虑RNA是否被部分降解。如果从cDNA开始做，可能是样品被污染。
3、目的基因表达降低，那么目的基因的CT值将增大。病利组的delta CT应该比正常组的大。

请教大侠，我的标准曲线的slope总是大于４，而且每个梯度的平行ct值差别比较大，这是是原因．请赐教．谢谢先了！

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这个斜率是＝1/LOG 10(扩增效率)，理论上扩增效率＝2，斜率是3.322。如果斜率大于4，说明扩增效率比较小。可以考查一下反应体系是否合理？酶活是否正常？

平行管的CT值差别大可以考查一下自己实验操作是否规范，另外一种原因就是仪器本身的误差也可能会导致CT值差别比较大。

请教一下那个ROX染料是什么作用？
一直不知道

还有在融解曲线刚开始做的时候
样品会升到95度几秒钟
然后才从60度开始－－到90度
为什么要95度，而且此时的荧光值会突然大大增加？

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ROX的作用ABI宣称是用来校准加样误差的。
但是据说ROX的作用实际上是用来校准光程差的。即每个孔的荧光信号经过滤光片在经过聚焦到CCD的时候，走过的光程是不一样的，这样在CCD上成像的亮度就不一样了。所以需要把这个差异用ROX来计算孔间差异有多大，然后差异系数去处理，实际的荧光信号。具体过程我不是非常清楚，请高手指正。

不知道你从哪里看到需要先95度？图上的位置应该也不是95度。

这个斜率是＝1/LOG 10(扩增效率)，理论上扩增效率＝2，斜率是3.322。如果斜率大于4，说明扩增效率比较小。可以考查一下反应体系是否合理？酶活是否正常？

平行管的CT值差别大可以考查一下自己实验操作是否规范，另外一种原因就是仪器本身的误差也可能会导致CT值差别比较大。

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当斜率为4的时候，扩增效率是77.8%，斜率大于4的话，效率继续下降。
扩增效率的问题实际就是引物的扩增效率，可能酶活的关系没有那么重要，前提是试剂盒的质量有保证。回到扩增效率，只有在引物和模板处于最适比例时才能得到比较满意的扩增效率，因此通过调节PCR反应体系中的引物终浓度来解决，可以做一些引物梯度来比较。