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标题:【讨论帖】定量PCR实验技术分享（解答定量问题）

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发表于 2014-7-29 13:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问，溶解曲线主峰后面有许多杂峰是怎么回事，主峰前面很好。十分感谢！
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发表于 2014-7-29 13:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也想问几个低级的问题：
  1.一般看家基因（如actin与GAPDH）的CT值在什么范围内比较合理，我们同学的一般经验是10-18，并且认为如果看家基因的CT值大于20，则模板浓度太稀了，结果就不可信了。是否真的如此呢？有时候反转录的cDNA浓度就是很稀，我也没办法啊==！，模板比较稀的时候得到的定量PCR结果到底可不可信？
  2.两个需要对比的样品之间，看家基因的CT值之差大于多少的时候，定量PCR的结果不太可信呢？我身边流行的说法是两个样品看家基因CT值差异大于2，结果就不可信，因为这样两份样品的浓度差异约4倍以上，完全没有可比性，事实是怎么样的呢？
  PS：以上说的问题都是在溶解曲线很好，无引物二聚体，4个孔之间重复性还比较好，不会是配样的问题时出现的，怎么样的定量结果才是可信的，违背了那些原则的结果是不可信的？
期望解答，万分感谢！
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发表于 2014-7-29 13:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教大虾：

我做质粒的real-time，为什么1：最后的荧光强度比较低，一般也就在10左右，有的只有5、6？
2：为什么同样一份DNA样本重复测量几次，总是Ct值差不多比较正常，但最后荧光强度能差很大，不知是何原因？
3、我的扩增曲线不像典型的指数增长那样很快达到平台期，总是斜着上去，感觉曲线比较平，而且到40个循环也还没到平台期？我试过调整酶量和退火温度都没什么用。

多谢指教！
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挖挖挖[使用道具]
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发表于 2014-7-29 13:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
本人做过几年的定量PCR，有一定的经验。看到版里头有许多战友对定量有许多问题。愿意就定量PCR的问题与各位战友一起探讨。

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你好，我有一问题请教：
我做实时荧光定量PCR检测乙肝病毒DNA实验时，不是高含量样本；有时扩增曲线在15循环内就有抬头，后来又有一抬头。有一次4个标准中有两个也出现这种情况。不知何原因，请指教，谢谢！
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