【讨论帖】定量PCR实验技术分享（解答定量问题） - 经验共享

PCR仪 » 讨论区 » 经验共享 » 【讨论帖】定量PCR实验技术分享（解答定量问题）

255 5/26 |‹‹‹3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ›››|

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【讨论帖】定量PCR实验技术分享（解答定量问题）

考拉乌拉拉[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76538
精华 0
积分 151
帖子 62
信誉分 100
可用分 1021
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态离线

发表于 2014-7-27 16:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教：1. thresthold该怎样设置合理？根据Ct 值么？那Ct 值在多大范围内好呢？

2. 我要做的探针法，有几个目的基因要做，是每一个的扩增条件都不同么？

本人是新手，先谢谢拉！

memory[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76531
精华 0
积分 378
帖子 436
信誉分 100
可用分 2962
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态离线

发表于 2014-7-27 16:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还请教一下：

如果每个扩增条件不一样，那每一批都要跑内参么？

standbyme[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75190
精华 1
积分 365
帖子 405
信誉分 102
可用分 2821
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

发表于 2014-7-27 16:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我还有一个疑问：定量的国际标准浓度是100000IU/ml，而所测的基因定量值是5×100000拷贝，它们之间的关系是什么？后者表示每ul有500000个拷贝，还是每ml有500000个拷贝？

挖挖挖[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76463
精华 1
积分 208
帖子 112
信誉分 102
可用分 1301
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2014-7-27 16:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 考拉乌拉拉 于 2014-7-27 16:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教：1. thresthold该怎样设置合理？根据Ct 值么？那Ct 值在多大范围内好呢？

2. 我要做的探针法，有几个目的基因要做，是每一个的扩增条件都不同么？

本人是新手，先谢谢拉！ ...

thesthold的设置，
因为定量的基础是假设指数扩增期之前的扩增效率都是接近2的一个定值。所以设置thesthold一般设置在刚起跳不久，也就是比较接近于零的位置，软件有默认的thesthold，一般采用软件默认的就可以了。如果设得很高，这时候反应体系里头的一些资源已经处于短缺状态，扩增效率无法接近2。这时候就没有什么理论依据了。
一般采用探针法来定量模板数量的时候都是希望能在一个管里头来做多重反应，这样的反应条件比较一致，同时能减少实验操作。那么这时候的扩增条件主要是各对引物的TM值要保持一致，而且不要相互有配对的现象。当然扩增条件是一致的。

挖挖挖[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76463
精华 1
积分 208
帖子 112
信誉分 102
可用分 1301
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2014-7-27 16:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我还有一个疑问：定量的国际标准浓度是100000IU/ml，而所测的基因定量值是5×100000拷贝，它们之间的关系是什么？后者表示每ul有500000个拷贝，还是每ml有500000个拷贝？

==============================================================================================================

不是很明白你说的国际标准浓度是什么意思？你这个问题似乎是两个问题，1IU是怎么定义的？2、5×100000拷贝是什么意思？

有些药物如维生素、激素、抗生素、抗毒素类生物制品等，它们的化学成分不恒定或至今还不能用理化方法检定其质量规格，往往采用生物实验方法并与标准品加以比较来检定其效价。通过这种生物检定，具有一定生物效能的最小效价单元就叫”单位”（u）；经由国际协商规定出的标准单位，称为”国际单位”（IU）。国际标准品主要是供给各国来建立和标化自己的国家标准品。对于还没有建立国际标准品的药物可以由本国制订国家标准品。

5×100000拷贝应该是说一个反应体系中有这么多个分子，那么就看你加入多少ul的模板了，把5×100000除以你的模板体积就等于你的浓度啦。单位是拷贝/ul。

gogo[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77052
精华 0
积分 821
帖子 1341
信誉分 100
可用分 7487
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态离线

发表于 2014-7-27 16:34 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我还要请教一下：

1、我有4个目的基因要做，因为同源性较高，所以采用探针法。包括内参那

   就是5个基因了。我是不是每个目的基因都分管加啊，内参也要分开加?

2.  我用的是ABI7900HT,今天做了内参和一个目的基因预实验，跑了40个循环

   两者都没到平台期，扩增曲线光滑，起跳也在18－35之间,经过Delta Rn处

   理能看出S形，这样的数据行么？这样的条件能用么？后来，老师建议我

   跑55个cycle试试，可有人说55个也没用，到底怎么办捏？谢谢拉！

redbutterfly[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76433
精华 0
积分 701
帖子 1102
信誉分 100
可用分 6281
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2014-7-27 16:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我还想请教你一下标准品的问题。
我要用质粒标准品对我的目的基因定量，这属于相对定量还是绝对定量？还有质粒标准品的扩增条件和我要的目的基因的扩增条件不一样，这样推断出我的目的基因的拷贝数准确吗？
我是新手，很多概念都不是很清楚，问的问题可能很搞笑，请见谅。我看论坛上有些战友说的意思好像是标准品还要克隆到T载体上，完全被搞糊涂了，不知道使用标准品的具体步骤是什么，希望你也能给个详细的解答。谢谢。

chuntian1983[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76393
精华 0
积分 421
帖子 522
信誉分 100
可用分 3423
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-4
状态离线

发表于 2014-7-27 16:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你好，我还想再请教你个问题，想了好久想不通。
我用试剂盒的话，可以将模板等比稀释5个梯度，但是自己配制的体系怎么都达不到5个梯度稀释，这到底是为什么？

zbboom[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 114497
精华 0
积分 340
帖子 360
信誉分 100
可用分 2600
专家分 0
阅读权限 255
注册 2013-9-25
状态离线

发表于 2014-7-27 16:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

急急急！！！！请问能否用质粒DNA作为real-time RT-PCR的标准品呀？有必要将它转化到T载体上，挑克隆来制备吗？

挖挖挖[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76463
精华 1
积分 208
帖子 112
信誉分 102
可用分 1301
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2014-7-27 16:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 zbboom 于 2014-7-27 16:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

急急急！！！！请问能否用质粒DNA作为real-time RT-PCR的标准品呀？有必要将它转化到T载体上，挑克隆来制备吗？

将目的基因插入质粒DNA中，然后转化到细菌中，扩增，再收集质粒，把这样的质粒作为标准品。
因为质粒比较容易知道它的分子量，那么通过测定OD值可以知道质粒的总质量，然后就可以知道质粒的真实的浓度了。

255 5/26 |‹‹‹3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ›››|