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标题:【讨论帖】定量PCR实验技术分享（解答定量问题）

挖挖挖[使用道具]
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发表于 2014-7-27 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我还想再请教你个问题，想了好久想不通。
我用试剂盒的话，可以将模板等比稀释5个梯度，但是自己配制的体系怎么都达不到5个梯度稀释，这到底是为什么？

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这个应该是必须你自己的分析。但是大致的方向应该是自己配制的反应体系扩增效果没有试剂盒好。
毕竟，试剂盒是人家多次实验研发优化出来的。你自己配置的体系先经过优化之后，应该也可以。
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小螺号[使用道具]
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发表于 2014-7-27 16:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先，谢谢你的回答！
按照您的说法，质粒DNA可以用做real-time RT-PCR的标准品吗？需不需要将目的基因插入质粒DNA中，然后转化到细菌中，扩增，再提取总的RNA（包括细菌和质粒的RNA），然后逆转录成cDNA, 把这样得到的cDNA作为标准品
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idea2011[使用道具]
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发表于 2014-7-27 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问：做大规模临床患者血清某种成分的PCR，大约100人份，需要每人分别做么？大约需多少钱，您有没有比较经济可靠的方法可以推荐给我们。谢谢！
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发表于 2014-7-27 16:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先，谢谢你的回答！
按照您的说法，质粒DNA可以用做real-time RT-PCR的标准品吗？需不需要将目的基因插入质粒DNA中，然后转化到细菌中，扩增，再提取总的RNA（包括细菌和质粒的RNA），然后逆转录成cDNA, 把这样得到的cDNA作为标准品

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提取的是质粒DNA，而不是质粒RNA。直接拿质粒DNA来作为标准品。
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发表于 2014-7-27 16:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问：做大规模临床患者血清某种成分的PCR，大约100人份，需要每人分别做么？大约需多少钱，您有没有比较经济可靠的方法可以推荐给我们。谢谢！

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我不知道你是要知道每个人的血清中含有多少成分，还是只是需要知道这一批血清中是否被污染了？能否更加详细地说明一下你的实验目的？你说得多少钱是要我帮你推荐其他人帮你做的价格还是自己做的试剂成本？
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发表于 2014-7-27 17:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢您的帮助，我们想做冠心病患者血清中IL-6基因多态性，与正常人比较，需要约100例患者，我们想知道自己做大约需多少经费，因我们没有基础，想知道是否容易出结果，十分感谢！！
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发表于 2014-7-27 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教质粒DNA的存在会不会干扰SYBR的荧光检测？我电泳条带中的质粒jiyinＤＮＡ如何去除？
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yyaxw84[使用道具]
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发表于 2014-7-27 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢您的帮助，我们想做冠心病患者血清中IL-6基因多态性，与正常人比较，需要约100例患者，我们想知道自己做大约需多少经费，因我们没有基础，想知道是否容易出结果，十分感谢！！

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请问你知道具体的位点吗？位点多吗？位点太多不适合 real time pcr。
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挖挖挖[使用道具]
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发表于 2014-7-27 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教质粒DNA的存在会不会干扰SYBR的荧光检测？我电泳条带中的质粒jiyinＤＮＡ如何去除？

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sybr是要嵌入双链DNA中才会发荧光的，所以如果模板浓度太大的时候，质粒DNA是会对检测有所影响的。但是正常情况，我们让扩增曲线在十几个循环之后起跳，也就是说要求模板浓度不要太高。所以正常实验，质粒DNA不会对SYBR的荧光检测造成影响。

你在电泳的时候，如果使用正常的质粒DNA模板的浓度，跑电泳的时候质粒DNA的条带不会出现，因为浓度太低。
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挖挖挖[使用道具]
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 小中大


QUOTE:
原帖由 yyaxw84 于 2014-7-27 17:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
非常感谢您的帮助，我们想做冠心病患者血清中IL-6基因多态性，与正常人比较，需要约100例患者，我们想知道自己做大约需多少经费，因我们没有基础，想知道是否容易出结果，十分感谢！！

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    一百例就是稀释一百倍，一般试剂盒是能有这个灵敏度的，所以你可以把一百多个人的样本混合，要混合均匀，做成MINI POOL，而后检测MINI POOL就可以了。看不同产家的吧，价格不同。
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