PCR仪

请问：为了节省金费，本人用了25ul反应体系，但在软件输入反应条件时却忘了更改（50ul）不知对实验结果是否会有影响？
谢谢！

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问题应该不大，输入反应体系体积我个人认为是PCR仪用于计算控温的时候能够更加准确地测定反应体系中的温度。但是25ul和50ul之间产生的温度差别对结果影响应该不大。

thesthold的设置，
因为定量的基础是假设指数扩增期之前的扩增效率都是接近2的一个定值。所以设置thesthold一般设置在刚起跳不久，也就是比较接近于零的位置，软件有默认的thesthold，一般采用软件默认的就可以了。如果设得很高，这时候反应体系里头的一些资源已经处于短缺状态，扩增效率无法接近2。这时候就没有什么理论依据了。

     是不是手动设置有几条基本原则：基线盖过所有阴性曲线，基线尽量位置最低，尽量位于曲线拐弯处？
      为什么据此原则设置的基线与软件默认的不同呢？哪个更准确些？
      多谢指教！

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thesthold和基线是两个概念，注意区别。

指数扩增期有一段区间，这段区间内你都可以认为它的扩增效率都是一样的，所以thesthold只要设置不是太高，都是有理论依据的。

我把模板做梯度稀释，为什么原始浓度的Ct值比1/10稀释的Ct值还低？

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这个的意思是原始浓度的Ct值数值比1/10稀释的大

可是我前段时间做过浓度更大的样品，它的1/10稀释比这个样品的原始浓度还大，跑出了很低的Ct值，所以按理论，这个样品应该能得出对应的Ct值啊。

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这个“很低的Ct值”是指数值低
不好意思，我把它们弄混了