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标题:【讨论帖】定量PCR实验技术分享（解答定量问题）

wzqzy[使用道具]
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发表于 2014-7-27 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Rn Vs Cycle的曲线 是不是就是△Rn VS Cycle 图啊？

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delta Rn是Rn取log 10。有没有Rn对cycle的曲线
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ROSE李[使用道具]
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发表于 2014-7-27 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教各位：
我想做真菌定量PCR，那标准曲线的需要的真菌菌液有标准品吗？需要自己配制吗？比浊法怎么做？谢谢

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定量PCR只是定量真菌中的某一个基因的，你 把这个基因扩增出来之后，构建到质粒中，然后将质粒转化到E.COLI中，扩增细菌，就扩增质粒，然后抽提质粒，对质粒用OD260测定浓度，OD与质量浓度之间可以相互转换，这样就可以知道质粒的质量了，质粒的分子量是已知的，这样就可以知道质粒的摩尔浓度，也就是可以知道一定体积中有多少个质粒了。这就是标准品。具体中间的过程请自己查阅相关的基础知识。
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-7-27 17:38 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
帮我看看我的图图吧 以前的还可以总是觉得不理想 所以重新设计了引物，谁知道却是这个样子的，急啊愁啊 我用的是SYBER GREEN I 用的是strategene的仪器，做的是半定量 一步法 直接用的RNA做的模板。

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问题应该出在引物上 吧，第一，有引物二聚体，第二，感觉PCR产物不是很纯，有非特异性扩增，不知道有没有将定量PCR产物拿来跑过电泳，是否有非特异性的条带？请记住，引物设计好之后一定要拿到NCBI上去BLAST一下，看是否会与其他基因比较相似，最好的是只有与你的目的基因完全配对，与其他基因差别比较大。这样不会产生非特异性扩增。
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发表于 2014-7-27 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先谢谢你的回答 我的引物是刚刚设计的，BLAST后效果很好的，这条引物是从牛津大学的引物库中引用的，应该信得过，另外我做了电泳，目的基因142bp没有出来，倒是出来了两条非特异带,内参基因还可以，就是融解曲线不行，咋办？如何继续摸索呢，提高退火温度吗 那内参咋办呢以前做的内参就是这个退火温度，效果要比这个好的多，不知道为何，现在融解曲线不能用了
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bluelake[使用道具]
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发表于 2014-7-27 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做荧光定量PCR已经快半年了，但是有一个问题一直无法解决，望大虾指教，多谢。问题是：标准品是qiagen试剂盒提的质粒，紫外分光光度仪进行核酸定量，计算出拷贝数/ul，然后10倍倍比稀释，从10*8~10*1/ul作为各梯度的标准品。
反映体系20ul，模板2ul。10*3、10*2、10*1及阴性对照，曲线几乎重合，无法分开。10*8~10*4的线性关系都很好，r值为1.7。
方法尝试过taqman和SYBR GREEN，都没法解决这个问题。
问题可能出在哪里？先谢谢了。
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seagate[使用道具]
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发表于 2014-7-27 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
大侠：我现在正做荧光定量PCR，想请教几个问题
1。我以表达某个基因阴性的细胞序列稀释表达阳性的细胞，抽提RNA、RT、real-time PCR,怎样才能确定检测的敏感度呢？要不要做统计？
2。内参的该怎样选择？有必要同时做内参的标准曲线吗？

谢谢！
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2014-7-27 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问：
        我所用的ABI7300，一次可以做96个标本，用它公司配套的96孔板，上面是贴膜的。
        我的标本理论上讲CT值不同，可是结果却差不多，当时我怀疑是不是系统反应时标本与标本之间混合了（因为是贴膜的），可老师说如果是混合了，荧光也显示混合。
        请教高手出现此现象的原因，谢谢！！
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wanglaoshi[使用道具]
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发表于 2014-7-27 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教引物的问题，谢谢解答！
我做的细菌是放线菌，粘性放线菌和内氏放线菌是我们实验室做的最多的，因此有标准菌，但是我的实验中还包括一些其他种类的放线菌，实验室里面并没有标准菌，我在genebank上下载到了这些放线菌的基因序列，并设计出来了引物，本来应该用标准菌检测一下引物的特异性的，但是如前面所述，没有标准菌，请问还有没有方法可以检查引物的特异性，比如在pubmed上有blast打分，能不能检测特异性，会不会得到公认？万分感谢！
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发表于 2014-7-27 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

sybgren做 real time 如溶解曲线和电泳结果好。能否不用加延伸温度（>非特异物TM小于产物）?

加了那个延伸温度,并不一定能把sybgreen 1 的溶解曲线的双峰变为单峰?

条件优化 与加了那个延伸温度,比那个效果更好
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yyaxw84[使用道具]
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发表于 2014-7-27 17:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
急急！

请问：
我所用的ABI7300，一次可以做96个标本，用它公司配套的96孔板，上面是贴膜的。
我的标本理论上讲CT值不同，可是结果却差不多，当时我怀疑是不是系统反应时标本与标本之间混合了（因为是贴膜的），可老师说如果是混合了，荧光也显示混合。
请教高手出现此现象的原因，谢谢！！
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