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标题:【讨论帖】引物质量直接影响PCR结果！

yhz1973[使用道具]
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发表于 2014-7-29 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问：如果之前没有做PCR的经验，由于课题需要测定受体含量，而放射配基结合法本地区又测不了，自己用PCR测受体的mRNA，会不会太冒险，因为时间和经费都是很有限的.
望大侠们指教！！多谢！！
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greenbee[使用道具]
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发表于 2014-7-29 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
如果熟练，又引物质量首先保障，测定MRNA的表达是可以说明一定问题的，但是，不能在生工合成引物，而且正如楼上很多朋友讲的首先验证引物。
还有，RNA提取过程不简单，生手有时候什么也提不到。不过，如果有操作其他试验的经验，提取RNA还是不成问题的。有的老手不用DEPC处理品都能提到并P的很好（当然速度重要）。
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utt0989[使用道具]
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发表于 2014-7-29 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
测序发现上下游引物完全一致，应该不怪人家生工，扩增条件调整不好的情况下，会出现只有单引物扩增条带，这是我们实验室经常出现的问题，你应该做上下游单引物扩增的对照。
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okhaha[使用道具]
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发表于 2014-7-29 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
生工的引物，我用了还没有发现什么问题，但是去年暑假的时候真的是把我们害死了，DNTP有大问题，用做RT一直不出，因为同样的DNTP做PCR却没有问题，所以一直没有怀疑它，一偶然的机会换了DNTP做RT，就出来了。三个月，实验室做需要反转录的病毒的都没有任何进展。所以，我们现在也很少用他们的东西了。
       其实，人力和财力不是最重要的，时间才是浪费不起的。
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zhezhe[使用道具]
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发表于 2014-7-29 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
上游和下游引物一样的原因，是生工的代理在发送E-mail的时候，将引物复制错误了，呵呵，不是我们自己的原因。我的网站在百度搜索“生工引物”，出现的第二个主题就是我的网站，我的网站有更加详细的内容。
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zhenxin[使用道具]
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发表于 2014-7-29 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常同意你的观点，金钱是次要的，时间才是最重要的！！如果不是这样，我怎么能放过生工给我造成的损失！我怎么能放弃索赔！他们的总工王珈璐在E-mail对我们不索赔表示了赞赏和感谢，可是，他们不了解，我索赔的内容他们没有办法赔偿，因为我要求赔偿时间！！！
呵呵....我宽容吗？不要金钱赔偿就是宽容吗？虽然没有索赔金钱，可我心里到现在对我损失的时间耿耿于怀！
我的网站：在百度搜索“生工引物”，第二个主题就是我的网站BBS。我也有首页的。我们微生物室做了自己的网站，并且希望将网站做成业内人员经常光顾的家。
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tie8[使用道具]
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发表于 2014-7-29 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
都会出错，我该怎么选？已经错了一次，我能相信错误的概率已经过去了吗？公司出错几率越大我们碰上的机会就越多，哪个公司的几率更大呢？光看出错的例数是不能说明问题的，那我怎么来比较呢？

没有办法，就用楼上的办法吧，都订了试试，实在是耽误不起这时间了呀

运气啊。运气好的话，即使只有1%的正确几率，碰上了，那就是百分百，一切顺利，万事大吉；运气不好，0.1%的错误，碰上了，时间，金钱，精力，名誉，自信心..........任何赔偿相对于损害都是九牛一毛
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eve_49[使用道具]
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发表于 2014-7-29 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的思想非常有代表性。最初，我遇到生工引物第一对错误的时候，想，错误是难免的，既然这次错了，从统计学角度出发，下次一定是正确的，万万没有想到的是，我竟然接连几次都是错误的，错误率占我启用引物的40％（16对引物中，启用10对，错误4对）。
上述内容不能不让任思考，引物的错误与选用的公司相关。
最近，我们公司用了伯亚的，幸运，21对中还没有错误出现........
其实出现1～2次错误我们是可以忍受的，我们不是不讲道理的用户，我们还是非常体谅公司的难处的。在我的网站，我就粘贴了申能合成引物的问题讨论，部分内容诉说了公司合成引物的无奈。
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toy[使用道具]
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发表于 2014-7-29 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
其实，看了楼上的发言，引物合成回来好像都没有核对，就开始做试验了。我是有教训的，反复做了近一个月，结果总是不理想，最后发现是引物序列出了问题。所以，以后做试验，都要认真核对引物序列，标出引物在DNA序列中的位置及PCR产物的大小，这样做试验心里才有数，便于以后分析原因，节省时间。虽然核对的过程很单调，有时眼睛都要看痛，但对自己负责嘛，还是值得的。

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怎样核对引物呢？
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dog002[使用道具]
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发表于 2014-7-29 15:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

半年前在生工合成一对引物，少了一个碱基（测序结果显示）
前不久在上海英骏合成了一对引物，测序结果（在英骏测序）显示也少了一个碱基
不知道是相信英骏的引物合成还是它的测序，郁闷～～～～～
实验都不敢往下做了
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