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标题:【转载】【讨论帖】snp、测序问题专贴

ffaa[使用道具]
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发表于 2014-7-29 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果和你以前的实验矛盾
建议反向测序就没这样的了
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is2011[使用道具]
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发表于 2014-7-29 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您是指的RT-PCR得到目的DNA的那一步吗?我是跑胶，切胶，纯化后再接载体的。1.现在测序的图上看是因为套峰所以判断为纯度不够所致吗？我的质粒的260/280在1.8左右啊还不行吗？2. 还有可能是其他的什么原因吗？

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不是纯度问题
是感觉你转进去的都是pcr的小片段
不是你的目的产物
这样是靠od无法判断的
只能把转好的质粒加空载一起电泳
看你插入的片段多大
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发表于 2014-7-29 17:31 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想问下楼主如果用二次PCR产物直接纯化测序这样的结果可靠吗
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发表于 2014-7-29 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
2次pcr可能会产生非特异性扩增
不仅会有非特异性条带，有时主带也是非特异性的
可以测序，但要看电泳结果，测序后要比对你的结果
看是不是你所需要的
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finger[使用道具]
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发表于 2014-7-29 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以啊，一般的酶的错误率是很低很低的，没有关系的，临床检测上也有两次PCR的产品。可以的
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kulee[使用道具]
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发表于 2014-7-29 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以啊，一般的酶的错误率是很低很低的，没有关系的，临床检测上也有两次PCR的产品。可以的
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greenbee[使用道具]
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发表于 2014-7-29 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

个人认为这不是模扳量问题
他的原始run data并不是很高
而且一直比较平稳没有出现急剧下降的情况
2侧的荧光信号质量都很好，没有迹象表明是
模扳过大
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kuaizige[使用道具]
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发表于 2014-7-29 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用PCR的方法提取了目的基因，连接到T载体后在大肠杆菌内转化，菌落PCR可以扩增出目的片段，再选择PCR阳性的菌落提取质粒，再进行PCR验证阳性。送去联合基因测序，说杂峰太多，没结果。请各位帮忙分析下，是怎么回事。苦了好几个月了，又是一场空啊。
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nut6694[使用道具]
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发表于 2014-7-29 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不是看峰高低的，要看信号的高低的，都1000以上了
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sunbent[使用道具]
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发表于 2014-7-29 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
用PCR的方法提取了目的基因，连接到T载体后在大肠杆菌内转化，菌落PCR可以扩增出目的片段，再选择PCR阳性的菌落提取质粒，再进行PCR验证阳性。送去联合基因测序，说杂峰太多，没结果。请各位帮忙分析下，是怎么回事。苦了好几个月了，又是一场空啊。

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这关键在于质量提取以后dna德模扳量
不知道你们是否跑电泳或者定过量
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