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清洁级200-250gSD大鼠，断头处死，无菌操作取一段胸主动脉，放入含双抗的DMEM的培养皿中，用直镊去除外周脂肪组织，眼科剪纵行剪开血管，弯镊刮血管内膜2~3遍，弯镊压住血管中段，另一弯镊向下刮下中膜，去除外膜组织；然后将中膜转移至另一培养皿中（预先加入1-2滴100%胎牛血清），弯剪剪成约1mm大小碎片，均匀铺在皿底，待其稍干燥后（约2-3mins），自边缘缓慢加入20%胎牛血清的DMEM培养基，注意勿使组织块飘起；轻轻转移至37% 5%CO2的细胞培养箱中静置培养，期间不要动，以免组织块飘起；约7-9天开始有细胞从组织块周围爬出，此时可更换培养液，继续培养；约14天左右细胞融合成大片，可进行传代；原代和第一代均用20%胎牛血清，以后为10%小牛血清；如果细胞长得较快，如3-5天长出，要怀疑是否有外膜成纤维细胞的污染。因此分离中膜和外膜非常重要。
