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人外周血单核细胞分离纯化步骤及培养
1:将枸橼酸钠或者肝素抗凝的全血(枸橼酸钠用量为100ml全血用10ml2.5%的枸橼酸钠)用生理盐水1:1比例稀释混匀。
2:把稀释的全血按2:1比例缓慢沿试管壁铺在淋巴细胞分离液(比重1.077)上,室温下2500r/min离心20min(离心时应根据离心管径和离心半径差异,设定rpm,最好能设定加减速,加速设定为4,减速设定为0。10ml离心管一般可忽略加减速影响)(15ml离心管一般加7-10ml稀释的全血,加5ml淋巴细胞分离液,用尖吸管小心吸出中间的云雾层细胞至另一离心管中,用RPMI1640基培 1500转/min×10min洗涤2次。
3:将洗涤后的细胞重悬于含10%Human AB Serum ,2mM L-Glutamine,25mMHepes,10µmol/L2-MTT,青、链霉素的 RPMI1640中,调整细胞密度为5×106 cells/ml,台盼兰拒染试验示活细胞>95%.
4:将细胞按以上浓度接种于培养瓶中,置37℃,5%CO2培养箱培养2-4h后吸出培养基,用37℃预热的培养基清洗3遍,将未贴壁细胞洗脱。
5:用0.02%EDTA作用5-10min,然后用吸管轻轻吹打使细胞脱壁分离。
6:离心沉淀细胞,用上述培养基调整细胞密度为1-2×106cells/ml,种植于24孔板。
7:待细胞生长至80-90%单层融合状态时,给予无血清培养基静止12h以上,然后给予不同处理。