小中大这个是我们科现在做的提细胞的方法,拿出来大家共享!
荧光定量PCR技术检测白血病融合基因前单个核细胞的提取
1. 我们使用新鲜骨髓作为检测该项目的标本。当天标本要求当天处理，进行分离单个核细胞的操作。标本要求均为EDTA抗凝，肝素抗凝标本在PCR扩增过程中会影响扩增效率。
2. 标本来到后，准备15毫升高压消毒后的玻璃离心管，在离心管壁上作好患者姓名，编号的登记，防止混淆。
3. 将注射器中的骨髓标本注入玻璃离心管中。
4. 在已加入标本中的玻璃离心管中加入0.9%的生理盐水或者高压消毒后的PBS液，进行骨髓液的稀释，用滴管上下抽吸至混匀即可，不要猛烈至起泡沫。
5. 在另外的新的高压消毒后的离心管中，加入冰冻的人淋巴细胞分离液，每管大约为3－4毫升。
6. 用滴管将骨髓液体缓慢吸取，转移至装有淋巴细胞分离液的离心管中，轻轻的将标本打出到分离液的表层。
7. 离心机中离心，时间为20分钟，转速为2000转每分钟。
8. 离心后将玻璃离心管轻轻取出，注意不要晃动，造成分层的界限不清。
9. 用滴管将中间的白细胞层轻轻吸出，转移至高压灭菌后的2毫升EP管中。在EP管盖上做好姓名等标记，在小离心机中离心，速度1000以下，时间5分钟。
10. 取出EP管，用滴管或者加样枪将液体层取出，丢弃。此时可以看到沉降在EP管底部的单个核细胞层。
11. 再次用生理盐水或者PBS将细胞打散并且稀释，此步骤主要是为了清洗细胞，除去遗留的红细胞等。尽量不要残留过多的红细胞，会影响PCR检测的效率。
12. 再次按照步骤9离心，离心后取出EP管，去除上清液。
13. 加入生理盐水或者PBS液体，显微镜下计数。根据细胞数目进行分管。细胞数目按照Trizol的说明书进行分装。
14. 加入Trizol时，用加样枪反复抽吸至泡沫丰富，充分混匀，没有可见的细胞沉淀，溶液均一。如不进行提取RNA的步骤，将加了Trizol的细胞保存在－80摄氏度。
