液相色谱

现有的柱子是 C8的，北京普析的，目前流动相是乙腈，

问题1：我需要用的流动相是A液（磷酸盐缓冲液）与B液（甲醇—磷酸盐缓冲液，5:95）梯度洗脱，梯度为0-15min A液为100%，15-20min B液为100%，20-25min A液为100%，但是 色谱柱的说明书上有这句话：该柱固定相憎水性较强，建议流动相中应有5%以上的可与水互溶的有机溶剂（乙腈或甲醇），那洗脱的前15min和最后的 5min只有A液，里面没有 有机溶剂，这样对柱子伤害大不？

问题2：  流动相 过渡采用：先10倍色谱柱管体积的10%甲醇水冲洗（这样的甲醇水比例行么？我查了资料，有说50%甲醇的，也有10%的，糊涂了），再用B液平衡，这样过渡对不对？

对液相还在入门阶段，问题很弱智，希望得到大家的帮助！谢谢

问题1 你这个流动相设计是不太好的，一般一相选择有机相，一相选择水相，你这样有机相与水相混合不太合适。明确由说明不能使用纯水相做流动相的，有机相比例应该大于5%，目的是避免纯水相引起的色谱柱固定相坍塌，报废色谱柱。
问题2 由于你使用盐的比例较大，使用过渡流动相水相比例应该大，避免流动相中盐在高有机相中析出，堵塞色谱柱及液相系统流路，引起严重后果。选择10%甲醇水是合理的。

里面没有 有机溶剂，这样对柱子伤害大 C柱子都有规定的有机相不得小于10%
用的时候，先用有机相冲平柱子，然后用第一梯度平衡

问题1：憎水柱子（即反相色谱柱）如果用纯水冲洗后，如果立即停泵则由于其憎水（疏水）的缘故使得柱子内的水因而流失掉，长时间停泵使得柱子干掉（变干），会造成柱子内固定相填料表面键合的硅烷基结构塌陷（也说成是失去支撑倒下），柱子就这样报废了。那么一旦冲洗柱子用了纯水相怎么办呢？诶！不要惊慌，只要你不停泵，上述情况不会立即发生，我们只要保证最后用有机相冲洗柱子，停泵后使柱子内留存的是有机相，就无大碍，记住若遇到这种情况请不要停泵或者不要长时间停泵，而应立即过渡到有机相既可，另外还有长时间保存柱子是建议填料中充满乙腈，用乙腈保存C18反相柱子是最佳的，因乙腈为非质子型极性溶剂，为什么就不用我解释了吧。

问题2：我认为是说反了，你说的这个10%或50%过渡应该指的是液相使用中用含有缓冲盐的流动相，用完后如何清洗色谱柱的问题。我是这样理解的，可以用50%甲醇过渡到10%甲醇长一点时间清洗你的使用了含缓冲盐流动相的的柱子。

平衡时，一般每种流动相大概用多少体积啊？是以基线走稳为标准？

以基线平稳为准，多少体积都只是个说法。柱子每时每刻的情况不相同的。