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标题:【求助】PCR扩增没有条带，或条带特别弱

she[使用道具]
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发表于 2014-8-30 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 utt0989 于 2014-8-30 15:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

1. 你做PCR的模板是什么？cDNA还是基因组DNA呢

2. 你的模板加到了5微，那具体的量（ng）是多少呢？

3. 你的体系是体积，各成分的浓度是多大？

4. Extag还是相对容易扩出来的，扩增能力和你说的tag我觉得差不多，都是tag，就是保真性 ...

是cDNA,模板我做过梯度，1，2,4,5微都做过，但效果都不好，且1微没有出现条带，我用产物又扩增了一次，1微的出现了条带
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qhyu[使用道具]
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发表于 2014-8-30 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是cDNA,模板我做过梯度，1，2,4,5微都做过，但效果都不好，且1微没有出现条带，我用产物又扩增了一次，1 ...

===========================================================================================================

你的cDNA是从单一细胞系里面提取出来的吗，还是用的不同细胞系混合后的pool，建议都用几个细胞系或者组织的RNA，逆转录成cDNA作为模板，避免出现你要扩的基因的表达丰度在你选用的组织中很低
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发表于 2014-8-30 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问 Ex taq酶和LA taq酶有啥区别啊？与普通PCR所用的taq酶有啥区别啊？谢谢

===========================================================================================================

这三种酶对DNA扩增的增幅有差异，普通的taq，扩增10K一下（貌似一般也就扩8k左右）；EX taq 的话根据TAKARA公司介绍，质粒DNA能扩增到20k，基因组DNA能扩增到17.5k；至于LA taq，高于前两者，主要应用于长链DNA的扩增，TAKARA公司做过实验，质粒DNA有可能扩增达到40k，基因组有可能达到30k。这是其一，其二，普通taq，虽然也具备3'→5'的错配修复外切酶活性，但是较EX和LA相比扩增链的错配率还是很高，TAKARA公司给出的实验结果是，如果普通taq的错配率是100%，那么EX的错配率为33%，LA的错配率为20%，根据不同的实验目的，可以选用不同的taq。
以上为我个人查找的资料后个人的理解，如有偏差，或误述，见谅。
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ending[使用道具]
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发表于 2014-8-30 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的引物坏了吧？没有扩出来那么有没有引物二聚体出现呢？
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2014-8-30 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
主还是把您所用各成分及浓度都列出来，我们才好参谋！不过1次，2次PCR不理想也属于正常情况。
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发表于 2014-8-30 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我觉得用的酶比较关键 ，再就是二次PCR试试
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she[使用道具]
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发表于 2014-8-30 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 viviwang1987 于 2014-8-30 15:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
楼主还是把您所用各成分及浓度都列出来，我们才好参谋！不过1次，2次PCR不理想也属于正常情况。

buffer 2.5, dNTP 0.5,1.5,2, 引物1+1，EX Taq 0.3，模板 1,2,3，4，5都做过，共25微。
条件：TOUCHDOWN:94度5min，94度30S，53度30S，72度1min10S，10循环，每个循环退火温度降0.5度
                                             94度30S，46度30S，72度1min10S，30循环              72度5min
目的片段大小为1100bp左右
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she[使用道具]
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发表于 2014-8-30 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 ending 于 2014-8-30 15:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你的引物坏了吧？没有扩出来那么有没有引物二聚体出现呢？

有二聚体，而且还特别亮
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hold住[使用道具]
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发表于 2014-8-30 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
PCR反应主要由反应体系和反应程序决定，反应体系你可以参照标准体系微调，建议（25ul体系）：buffer 2.5ul,（Mg2+, 2ul）, dNTP 2ul, 引物各 0.4ul (25 pmol/ul)， Taq 0.2ul，模板 1ul, 用水补齐至25ul. 在体系中常做调整的成分是Mg2+用量（1.5~2.5ul）,模板。0.5~1ul.   反应体系一般为：94度4min，94度30S，53度（可变）30S，72度1min（可变），30循环，72度5min，10度保温。其中，退火温度和延伸时间根据目的条带调整，退火温度建议用梯度PCR确定，延伸时间大约1kb/min.  你在PCR扩增中用了降落PCR, 而降落PCR一般用于杂带去除，在此并不适用。建议：先检查所用试剂有没有问题，再核对各成分浓度及用量，然后确认程序。可以在前面问题排除的情况下，用普通程序做一下梯度pcr,模板可以先用之前扩增成功时的用量。
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cocacola[使用道具]
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发表于 2014-8-30 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

最主要是退火温度，模板浓度不是主要影响因素，做一个梯度试一下
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