【求助】5‘RACE二扩弥散 - 经验共享

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标题:【求助】5‘RACE二扩弥散

04906[使用道具]
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发表于 2014-9-24 14:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

哟西，不是这样啦，只是一些小调整，还是touchdown+nestle解决问题。
多设计引物么...我觉得设计得很好的引物假如模板是成功的话，应该可以连得上，因为引物在设计得好的基础上，成功与否关系就是模板质量和PCR的设置。盲目设一堆我觉得不如抽好一点模板。

看来程序本身没什么致命伤，就是模板让人摸不着头脑，过了这一周看看新的模板怎么样吧～～
5’end的毛病，完全非技术啊～～悲

yueban-1147[使用道具]
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发表于 2014-9-24 14:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一般设计三对引物，因为一次PCR时候程序对结果影响很大，但是nested pcr结果就很容易出来，设计多对的好处是，没必要在第一条外侧引物上费太多时间～～

dodoit[使用道具]
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发表于 2014-9-24 14:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也扩了N久了，同一批cDNA，其它人就能扩出来，我怎么换引物，怎么改条件都不行，真不知道是什么原因啊。。。。RP真的是低到极点了。。

seagate[使用道具]
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发表于 2014-9-24 14:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

几乎都是载体？没有插入序列吗，估计是没有克隆进去，测序之前最好检测一下，或者提个质粒，用质粒作为模板再PCR一下，保证有目的片段，我建议和楼下的一样，有时间去做TD还不如多设引物，PCR是否成功关键看引物，钓基因就是一个不断摸索引物的过程，不要去执着某一对引物，试不出来就换，别给老板省钱，最终做不出来还是害了自己的毕业。

04906[使用道具]
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发表于 2014-9-24 14:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

嗯，谢谢楼上几位的意见，但是我想没有人关注模板的质量？比如消化是否会对模板有影响？或者都已经站在模板无可挑剔的情况下谈操作？但是提mRNA不一定都是绝对完美的哟。明天重新提一次，不行再重设引物。
另外有个关于3'end测序的小问题，为啥找不到polyA，其他部分都对了，难道我的序列有一部分与通用引物的序列是一样的？？cuturl('http://bbs.bbioo.com/thread-88092-1-1.html')
测序公司说测通了，没发现问题，我的预计长度有900bp

ALALA[使用道具]
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发表于 2014-9-24 15:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

啊，我最近也在做啊，用的方法是cDNA 用TdT 加dCTP尾的，一次第一轮的时候还出来了带，但是不同基因带一样大的。。。还超出了预计的大小。。。。。。因为看的到，我就没做nest, 回收死活连不上T。。。。。。。
今天做第二次，第一轮什么都看不见，除了引物二聚体，我退火用的55度的，想着直接第二轮nest好了，现在正P着。。。

04906[使用道具]
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发表于 2014-9-24 15:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

今天重新5endRACE，继续拖带，已经重新设计引物两对...

主楼有更新，继续求教！！

koook5695[使用道具]
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发表于 2014-9-24 15:27 资料个人空间短消息加为好友

小中大

lz,你的RNA降解有些严重~~~
我看了你的问题。觉得有几点主要注意：
目的片段多大
5端是不是有局部高GC
有没有试过一扩和二扩都用普通PCR（非TD）

04906[使用道具]
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