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标题:【讨论帖】PCR问题交流

wood533[使用道具]
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为什么我做单管PCR时可以P出来,而做96孔板却P不出来了呢?想了半天想不出原因,给指点下哪些方面应该特别注意。
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请楼主帮忙回答一下这个问题,谢谢了
cuturl('http://ask.bbioo.com/ask/show-1922.html')

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首先一点你要确定你的目的,如果你要获得该基因的全长,包括5’帽子3’尾巴的话你就要扩增全部的cds并做RACE获得末端序列。
如果你要做基因表达,那么你就要确定你表达哪一部分,如果是表达全长的话你就要设计引物扩增全部的CDS并在引物的5’端引入酶切位点,如果泥只需要扩增它的活性功能区,那么你就要找到CDS中的成熟肽序列并设计带酶切位点的引物扩增。
至于具体的设计方法,请参考论坛其他引物设计的帖子,具体问题具体分析。
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各位  我在PCR时  没加模板 可总是有带,我一共有20多对不同的引物,不加模板,几乎都有带,不知道为什么!我的引物是分装的,而且 基本排除了污染。请问,这种情况,有无道理?

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没加模板有条带和你正常,那是因为形成了引物二聚体,一般很小,不超过200
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我也有个问题想请教,昨天做PCR,20微升体系,目的片段一个是300bp左右,一个是2300bp(、我当时不知道),我选的延伸时间是1min,结果做完电泳后发现后一个目的片段有两条很亮的条带,一个大约就是2000多,另一个在 ...

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我没有弄明白你的问题,你是在一个体系里P两种产物吗?
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请问一下,为何我的pcr产物检测时条带很浅,我已经设置了退火温度梯度,模板也是才提的,最近跑出的pcr条带一直很浅,请大家帮帮忙

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这个有很多的原因,除了退火温度之外,跟你模板的浓度及质量,taq酶的质量,循环次数都有关系。
建议你在不改变其他条件的情况下,分别增加模板的浓度,降低退火温度如降至49-50度,增加Mg离子及taq酶浓度等等。
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为什么我做单管PCR时可以P出来,而做96孔板却P不出来了呢?想了半天想不出原因,给指点下哪些方面应该特别注意。

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一般采用大管配体系再分装至96孔板的方法,这样保证你的体系不至于出现问题,另外你期间改变其他条件了吗
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whitesheep[使用道具]
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哇 延伸时间太长了吧  为什么要 -0.1°每个循环?不太有用吧!
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xue258[使用道具]
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请问我想PCR一个长约20,000 bp的基因,怎么分开做?谢谢各位大虾!
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qqq111[使用道具]
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前阵子,出差了,马上接着做,看看能不能出来!!谢谢各位达人帮忙!!!
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glass[使用道具]
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请教高手们,有扩增出10kb以上的片段的吗?
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