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标题:【讨论帖】PCR问题交流

XYZQ[使用道具]
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发表于 2014-9-26 10:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想请问一下 我做了几组PCR但跑出来的条带相同的 包括亲本和子代 问题是 试剂没有污染
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发表于 2014-9-26 10:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教高手们，有扩增出10kb以上的片段的吗？

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有啊，扩增长片段的PCR叫做长距离PCR，一般是扩增基因组DNA用的，需要用到特殊的酶和体系
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发表于 2014-9-26 10:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想请问一下 我做了几组PCR但跑出来的条带相同的 包括亲本和子代 问题是 试剂没有污染

=================================

很有可能是因为你的引物特异性不好造成的
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cocacola[使用道具]
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发表于 2014-9-26 10:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问一下PCR对模板的量有什么要求呢？一般多少？是不是越多越好？还有PCR电泳点样时对点样量有要求么？我刚进实验室，很多量的问题让我很头疼
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发表于 2014-9-26 15:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问一下PCR对模板的量有什么要求呢？一般多少？是不是越多越好？还有PCR电泳点样时对点样量有要求么？我刚进实验室，很多量的问题让我很头疼

======================================================

我不知道你是否认真看过宝生物的Taq酶说明书，上面说模板的浓度为
人基因组DNA 0.1ug-1ug
大肠杆菌基因组DNA 10ng-100ng
质粒DNA 0.1-10ng
λDNA 0.5-5ng
点样没有具体要求，用伯乐系统大孔最多能上50微（0.4g琼脂糖/40ml)
小孔20微
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发表于 2014-9-26 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问问我在扩增已知序列基因的CDS ，设计引物时搜索到引物扩增模板不能全部包含CDS区，该怎么办。
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发表于 2014-9-26 16:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 wiwi 于 2014-9-26 16:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我想问问我在扩增已知序列基因的CDS ，设计引物时搜索到引物扩增模板不能全部包含CDS区，该怎么办。

一看就知道你是用软件设计引物的，实际上真正的引物设计应该是自己设计为主，软件为辅，自己根据具体要求设计好后用软件检测才是上策，你遇到的问题是因为软件本身的缺陷造成的。你设计引物的时候按照大的原则自己大胆设计，再用软件检测。你扩增CDs引物就一定要包括全部的CDS
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发表于 2014-9-26 16:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想请问一下出现引物二聚体的原因有哪些？
是不是P不出条带的原因很多，dNTP、Mg、引物、DNA都有可能影响结果！
我每次是做2个引物，60个DNA  但是换了一批新的引物就老是白板，或者条带不清楚，还有二聚体的情况！这和染胶有关系么？
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发表于 2014-9-26 16:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

目前，有许多生物公司都推出了快带Taq酶，就可以实现快速PCR，其实这是通过牺牲PCR的准确率来实现的，也就是Taq酶识别DNA序列更加“模糊”，这样才能大大提高速度。
当然也有那种速度又快，而准确率也较高的产品，但也是高端产品，普通的快速Taq酶，建议大家用作检测之用吧。
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mnstyle[使用道具]
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 小中大
我认为这种情况一般是引物设计不合适造成的，建议你重新设计引物，增加引物的TM值，有个问题，你已知目的基因组序列了吗？基因组序列是由内含子和外显子组成，如果你根据CDNA序列设计的引物，有可能引物序列正好跨在内含子外显子交界处，又或是之间的内含子序列太长，再就是基因组序列中有复杂结构，需要你添加GC ENHANCER等，来促进复杂结构的解链。
另外，你说之后的实验发现条带不见了，有可能是你CDNA降解的问题，不知道你的RNA质量怎么样，反转录的效率又怎么样
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