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标题:【讨论帖】PCR问题交流

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发表于 2014-9-26 16:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
这个应该是二聚体的原因，基因上引物二聚体很容易形成，
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发表于 2014-9-26 16:23 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
Taq酶的延伸速度本来就是1-2KB/min，只不过针对于广泛的模板来说，保险的计算方法是1KB/min，其实Taq酶针对不同复杂程度的模板，其速度也不尽相同，一些比较简单的模板的延伸速度就是比较快一些，很正常。
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发表于 2014-9-26 16:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
使用LA Taq即可，不过，LA Taq没有末端加A功能
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发表于 2014-9-26 16:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
P不出条带的原因有很多，有可能是模板降解，引物溶解不好，或是PCR条带不好，当然也与buffer等有很大的关系，检查一下是否污染，buffer和DNTP一定要融化完全再取用。
要解决二聚体的根本方法就是重新设计引物，因为引物是最直接的原因，你可以试着减少引物用量，跟染胶是没有关系的
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发表于 2014-9-26 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大家好！
我想在目的片段上加上linker的基因片段，听说可以用PCR 的方法P出来，我试着设计好了加上linker基因的引物，但是不知道在进行PCR时具体是如何操作的！请大家不吝赐教，谢谢了
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发表于 2014-9-26 16:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

做PCR时，我们一般改变退火温度，循环数，那PCR的变性、退火、延伸的时间又应该怎么设置比较合适呢，我曾经试过三个温度相同，但变性、退火、延伸的时间稍有不同，结果就不一样了。我困惑，PCR的条件这么多，我们要怎么去找出合适的条件让我们实验得到满意的结果呢？
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发表于 2014-9-26 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
各位高人，大家好！我刚开始做实验，有个问题很困惑，想请教一下：我在做从全血提取DNA，请生物公司设计合成引物后进行PCR,跑胶为什么有些能出现条带，有些不能，跑出的条带在目的条带范围内，也没有二聚体，跑不出的就什么都没有，不知道什么原因。谢谢！
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发表于 2014-9-26 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
就是直接P就可以了，只要你的Linker不是太长就行，
如果加的Linker长一点的话，前几个循环先降一下退火温度，之后再恢复正常退火温度。
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发表于 2014-9-26 16:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
一般来说是有一个时间范围的，像变性温度随着模板的不同而变化，如基因组或菌液就需要变性时间较长，退火时间也是根据模板和引物的不同而有差异，延伸时间要看目的条带的复杂性及Taq酶的延伸效率限制。
总之，就是与模板的长短及复杂度和目的条带所限。
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发表于 2014-9-26 16:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
首先，生物公司合成的引物也不一定就百分百成功啊。
其次，你提取DNA的质量怎么样，不敢保证。
再次，PCR条件可能不合适，需要优化一下，包括PCR的体系，如果有复杂结构，或是高GC序列，就需要用特殊的buffer了。
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