【讨论帖】PCR问题交流 - 经验共享

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标题:【讨论帖】PCR问题交流

xue258[使用道具]
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发表于 2014-9-26 16:45 资料个人空间短消息加为好友

小中大

想用self-priming的方法将两个片段连接起来,片段A500bp（上下游引物分别为a,b),片段B 1700bp（上下游引物分别为c,d)。两个片段分别扩增的时候效果非常好，单一条带，也很亮，片段A，B混合，加引物a，d再扩，结果没能连上。两个片段大约有25bp的重叠，试过多种退火温度都不行，用的是TAKARA LA taq，请问要如何优化条件？

wiwi[使用道具]
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发表于 2014-9-26 16:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我在做基因的定点突变。一般基因定点突变的引物长度较长，25-35bp。这样引物的Tm值相应上升。在通常的情况下，Tm值决定退火温度，所以不应过高。但是《分子克隆》讲定点突变的引物Tm值一定要在75度或之上，同时其退火温度在55度-65度。。。。我不明白。。。请高手帮忙解答其对Tm值的要求和退火温度与Tm值间的怪异

zwsyrt[使用道具]
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发表于 2014-9-26 17:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.ISPCR中fish技术是什么？

2.实时荧光定量PCR中，SYBR荧光染料渗入到双链时发光吗？？？还是等到PCR延伸到有荧光染料的时候才发光呢？请解释PCR产物增加同荧光素成正比的原理？

3. ...

===========================================================================================================

1 FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。
2 SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

3 当然用RACE技术，关于两者的区别你可以再仔细看看课件中的PPT

XYZQ[使用道具]
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发表于 2014-9-26 17:03 资料个人空间短消息加为好友

小中大

想问下为什么pcr拖带这么严重，从洞孔一直下去

seagate[使用道具]
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发表于 2014-9-26 17:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

是smear现象吧。。。是不是地毯带？这是PCR体系有问题，能导致smear的原因太多，我不一一说了，你百度一下就可以找到。或者换个词搜索——“弥散”

seagate[使用道具]
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发表于 2014-9-26 17:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我在做基因的定点突变。一般基因定点突变的引物长度较长，25-35bp。。。。请高手帮忙解答其对Tm值的要求和退火温度与Tm值间的怪异
暗夜捕猎兽

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我不是高手，也斗胆说两句。

你是在做定点突变，那么突变点应该是在引物中间吧，也就是两边各有十几个bp的和模板完全配对，要注意，此时计算TM值时，只能计算5'端完全配对的序列，对于退火效率不高的酶，这个影响是很大的。所以即使你的引物长度有二三十个碱基，GC+TA计算TM超过七八十度，退火温度也只能放低，否则退火时连引物和模板的特异性结合都搭不上去~

或者你也可以尝试升温PCR，前5-10循环退火温度放低，有了足够量的完全匹配模板之后再用TM-5度左右退火完成PCR。

idea2011[使用道具]
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发表于 2014-9-26 17:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问下引物少一个碱基的后果是什么？

dodoit[使用道具]
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发表于 2014-9-26 17:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

DNA提取的质量对PCR影响大吗？为什么我的转化子（酵母）提取的DNA有时能扩增出来，有时重新提取后又不能扩增出来呢，如果，有影响那是怎么影响的？我怎么做才能提到满足PCr要求的DNA，请高人指点，

TNT[使用道具]
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