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标题:【讨论帖】PCR问题交流

xue258[使用道具]
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发表于 2014-9-26 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问下，我用线粒体基因组全序列为模板，设计引物扩增它，用primer5.0设计时，总是得不到理想的引物，总是出现错配，，是否因为引物长度相对基因组来说是很小的，所以很难避免它和基因组的非目的片段结合的位点很多，只能靠优化反应程序来解决？？？另外有文献报道扩增线粒体全序列所用的模板甚至是总DNA，那设计的引物其不是更容易错配，？？？？所以很困惑啊，很纠结啊，，也很想弄明白。。高人指点
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XYZQ[使用道具]
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发表于 2014-9-26 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想请教一下做荧光定量PCR时引物和探针应该先设计哪个？
是先设计引物还是先设计探针然后设计引物？
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birdfish[使用道具]
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发表于 2014-9-26 17:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请教一下，9月初的时候用primerstart高保真酶对质粒进行环式PCR扩增，进而实现对目的片段特异位点突变，退火温度53°的时候有目的片段，由于酶用完了，订购同样的酶继续做，可是在同样的条件，同样的模板引物竟然扩增不出来，然后我在此基础上又上下做了两个温度，还是什么都没有，请问这种情况该怎么处理呢？
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发表于 2014-9-26 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问下引物少一个碱基的后果是什么？

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你能否详细说明问题，是3'少了一个碱基还是5’还是在中间？一般来说，引物的中间少了会引起移码突变，3’少了影响不大，5'视情况而定
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发表于 2014-9-26 17:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
DNA提取的质量对PCR影响大吗？为什么我的转化子（酵母）提取的DNA有时能扩增出来，有时重新提取后又不能扩增出来呢，如果，有影响那是怎么影响的？我怎么做才能提到满足PCr要求的DNA，请高人指点，

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当然有影响，一般来说你的DNA提的质量（浓度，纯度）越高，你后续的PCR结果越好，反之就会影响你的结果
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发表于 2014-9-26 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想请问一下：PCR用内参的作用及原理？

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内参一般是用于定量PCR中组织表达分析用作参照，它是选用一些看家基因，看家基因在不同组织中表达是恒定的，这样就可以作为参照计算比较目的基因在不同组织中表达的差异
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发表于 2014-9-26 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请教一下扩增3000bp DNA 用来测序 PCR试验条件怎么摸 用的是LA酶 谢谢大家

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PCR中主要调整的条件就是退火温度，你这也属于长距离PCR了，建议你做退火温度的梯度
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发表于 2014-9-26 17:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我想问下，我用线粒体基因组全序列为模板，设计引物扩增它，用primer5.0设计时，总是得不到理想的引物，总是出现错配，，是否因为引物长度相对基因组来说是很小的，所以很难避免它和基因组的非目的片段结合的位点很多 ...

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首先说明一点，用软件设计引物不是不可，，但是电脑程序是死的，它不可能适应千变万化的模板序列，设计引物还是自己设计，只要几个大的原则把握住就行，其他的不用考虑。
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ALALA[使用道具]
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发表于 2014-9-26 17:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可能你的其他试剂有DNA污染
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大大大山楂[使用道具]
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发表于 2014-9-26 17:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您好！向您请教一个问题：一般在分子生物学试验中，想了解一个基因的功能，都怎么做？确切的说，具体的步骤如何？由于这方面的知识点非常零碎，我实在是想不明白了！谢谢您！辛苦！
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