【讨论帖】PCR问题交流 - 经验共享

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标题:【讨论帖】PCR问题交流

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发表于 2014-9-26 17:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

（1）请高手指点一下，17bp的引物跑PCR的时候能扩出条带来？在做多重PCR的时候，特异性怎么样？（2）设计兼并引物的时候给公司下订单的时候能直接下吗？例如引物序列为：atcgNtttatgac,那个N需要注明比例是多少吗？

pou[使用道具]
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发表于 2014-9-26 17:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请教：在做RT-PCR过程中，不同试验组别的标本中提出的总RNA浓度不一样，在下一步生成cDNA的过程中，加样时是否需要把总RNA的浓度调成一样，否则不能进行组间的比较？

00无名指00[使用道具]
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发表于 2014-9-26 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

模板相同，多对Tm值相当的引物混合之后进行PCR，扩增的条带大小相同，在50ul体系中，保证引物的总量达到10pmol，为什么扩增30个循环之后没有条带啊？

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发表于 2014-9-26 17:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近做overlap  pcr 同一批的东西  前面做三次都出了第四次就没了一周之内做的
后面把三个片段都新换了一遍  结果做了一个月  不管怎么调节基因比例  改变pcr条件
一直是在应该出现目的条带的位置之上涂抹  都快疯掉了
还有一个问题就是拿胶回收的overlap产物做模板（检验过是好的）也是扩不出来  电泳现象和上面overlap一样  我做的是单链抗体（scFv）基因的组装
高人能指点一下不？

viviwang1987[使用道具]
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发表于 2014-9-26 17:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用SDS法提取DNA时忘加KAc了，不过倒是提出了DNA的，请问对于PCR有影响吗？
还有，我跑PCR时老没条带，请各位高手指点指点。不胜感激！

xue258[使用道具]
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发表于 2014-9-26 17:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PCR扩增1600bp片段，一个月前的结果很好每次都出结果最近半个月用相同的条件做都没结果跑胶以后所有的产物都在孔里很亮就是跑不出孔用百分之一的胶
用的延伸时间是3分钟不可能扩出来那么大片段的请教各位大侠这是哪儿出了问题

orangecake[使用道具]
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