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标题:【求助】关于pcr条带不亮的问题

ilovegaga[使用道具]
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发表于 2014-10-7 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 feima+ 于 2014-10-7 10:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')



_ _！你。。。。
你PCR体系是按标准加的么？？
我一次cDNA可以P很多次

我要P六个基因，每个基因都P好多管...
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XYZQ[使用道具]
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发表于 2014-10-7 10:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
引物稀释成原来的四分之一和八分之一试试  其实pcr产物回收后够用就可以了 不必太追求亮度
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ilovegaga[使用道具]
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发表于 2014-10-7 10:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 XYZQ 于 2014-10-7 10:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
引物稀释成原来的四分之一和八分之一试试  其实pcr产物回收后够用就可以了 不必太追求亮度

谢谢你的建议。问题是，这亮度能回收吗？
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ilovegaga[使用道具]
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发表于 2014-10-7 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 XYZQ 于 2014-10-7 10:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
引物稀释成原来的四分之一和八分之一试试  其实pcr产物回收后够用就可以了 不必太追求亮度

早上重新做了次PCR，引物稀释1/4和1/8.   变性时间改为45s，退火时间没改。
跑胶看了下，条带都比以前亮。其中1/8的亮一点点。应该可以做回收。谢谢。
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ending[使用道具]
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发表于 2014-10-7 10:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


可能是模板放太多
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ilovegaga[使用道具]
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发表于 2014-10-7 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 ending 于 2014-10-7 10:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')


可能是模板放太多

是的，模板多是其中一个原因，引物也是其中一个原因。引物设计得不是很好，引物二聚体严重。另外一个目的片段，同样二次PCR，模板更多，也能P出很亮的带。

不过还好，经过优化条件后，目的片段都能回收到。

非常感谢各位的帮助！
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gemei0115[使用道具]
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发表于 2014-10-7 10:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
可以试试降低引物量增加模板量，另外就是可能你要P的基因本身表达量就不高
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wood533[使用道具]
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发表于 2014-10-7 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
个人建议，仅供参考！
1.模板量适当减少，建议使用一次PCR产物0.05ul-0.1ul，引物/模板的浓度与产物的特异性呈负相关；
2.如果你能确定一次PCR产物是目的条带，并且所用引物非简并引物，退火温度明确，建议不采用梯度PCR方法，因为一次PCR产物（目的片段）作为模板，引物和模板退火良好，适当提高退火温度能增强目的片段的特异性，降低非特异性条带产生能力；
3.根据楼主的电泳结果，推测楼主使用的是10X loading buffer，强烈建议改为6X的，部分电泳结果如果用10X的buffer上样，会在1500bp左右出现假带；
4.建议PCR体系尽量别变，不同体积的反应体系在同一PCR仪里，会产生不同的结果，个人认为可能和导热速度及受热均匀情况有关；
5.楼主拍照的时候尽量调节一下曝光时间和光圈大小，图片有些模糊。
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flower@@[使用道具]
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发表于 2014-10-7 10:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
信息要给全面才好分析啊。。
引物序列
目的片段长度及G+C
pcr体系组成，其中模板浓度也要
跑胶的marker大小
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pou[使用道具]
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发表于 2014-10-7 10:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


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原帖由 wood533 于 2014-10-7 10:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
个人建议，仅供参考！
1.模板量适当减少，建议使用一次PCR产物0.05ul-0.1ul，引物/模板的浓度与产物的特异性呈负相关；
2.如果你能确定一次PCR产物是目的条带，并且所用引物非简并引物，退火温度明确，建议不采用梯度PCR方法，因为一次 ...

稀释模板是正道
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