小中大【求助】用21F, 519R试图PCR 古菌，尝试了各种条件都P不出来...
如题，大小500bp。
尝试了改变退火温度（48-58，48-61℃），增加了DNA模板量（约50ng，100ng）改变了引物量（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0）,还尝试了用touch-down （55-48℃），结果都没P出条件。
大致的电泳图就是这样的，做左边和最右边有条带的都是marker中间的较亮的一条也是marker，只是添加了另一种核酸染料。
请问可以怎么改进？有没有人做过类似的试验？是不是我选的引物不好P出来呢？在我查看的文献里面，只要涉及到519R的都是通过先P21F,958R，再用touch-down pcr P一小段出来测序的。
